Russian Federation
Krasnoyarsk, Krasnoyarsk, Russian Federation
Cel' raboty – podtverzhdenie vidovoy prinadlezhnosti gol'cov, obitayuschih v ozere Melkoe. Zadachi issledovaniya: vylov gol'cov v oz. Melkoe, vzyatie biomateriala dlya PCR-testa, opredelenie fragmentov DNK, harakternyh dlya vida. Vylov gol'cov provodilsya na oz. Melkoe basseyna reki Pyasiny v sentyabre–oktyabre 2022 g. stavnymi zhilkovymi setyami s yacheey 30–55 mm, dlinoy 30 m i vysotoy v posadke 2 m na glubinah ot 9 do 14 m. Vremya ekspozicii 12 chasov. Temperatura vody – 6–7 °S. Biomaterial (myshcy hrebta) v kolichestve semi obrazcov (v dvuh povtornostyah) byl zafiksirovan v 95 %-m etanole, reakciya provodilas' v laboratorii AO «Krasnoyarskagroplem». Pered vydeleniem DNK myshechnuyu tkan' vymachivali v bufernom rastvore tris-gidrohlorida. Dlya vydeleniya DNK iz obrazcov biomateriala ispol'zovali nabor reagentov «Ekstran-2» proizvodstva firmy OOO «NPF Sintol», Rossiya. Dlya polucheniya ISSR-fragmentov DNK byli ispol'zovany mikrosatellitnye invertirovannye praymery (CTC)6G – CTC-CTC-CTC-CTC-CTC-CTC-G; (AGC)6G – AGC-AGC-AGC-AGC-AGC-AGC-G; (GAG)6C – GAG-GAG-GAG-GAG-GAG-GAG-C;(ACC)6G – ACC-ACC-ACC-ACC-ACC-ACC-G. PCR provodili v rezhime goryachiy start – 3 min/95 °S. Dalee 35 ciklov v rezhime: 1 min/94 °S – denaturaciya; otzhig praymerov – 1 min/60 °S; sintez DNK – 1 min/72 °S; dostroyka – 5 min/72 °S. Rezul'taty molekulyarno-geneticheskogo analiza svidetel'stvuyut, chto raspredelenie dlin i chastota vstrechaemosti fragmentov DNK yavlyayutsya harakternymi priznakami genoma gol'ca. Specificheskimi dlya gol'ca Dryagina yavlyayutsya fragmenty DNK dlinoy ot 200 do 1050 p.n. Poluchennye rezul'taty budut ispol'zovany dlya opredeleniya vidovoy sistematicheskoy prinadlezhnosti gol'ca pri vnedrenii v akvakul'turu Krasnoyarskogo kraya.
Dryagin's char, Salvelinus drjagini, molecular genetic testing, genome, DNA, polymerase chain reaction, nuclear DNA
Введение. Современный этап развития аквакультуры характеризуется поиском перспективных видов рыб, обладающих высокой пищевой ценностью, для внедрения в аквакультуру. В Красноярском крае к таким рыбам относятся представители осетровых и лососевых.
Из семейства лососевых наибольший интерес представляет голец, формирующий множество пресноводных и анадромных (миграционных) видов, объединенных родовым именем Salvelinus. Независимо от образа жизни и биологических особенностей все виды гольца являются источником красной икры и мяса с повышенной пищевой ценностью [1].
Среди озерно-речных гольцов выделяется голец Дрягина (Salvelinus drjagini). Впервые как вид эта форма гольца описана М.В. Логашевым в 1940 г. [2]. Он отличается от других видов (форм) крупными размерами и массой до 16 кг, что делает его привлекательным для введения в аквакультуру (рис. 1).
Рис. 1. Голец Дрягина (фото авторов)
Как отмечалось выше, среди гольцов отмечается много видов и форм, что требует идентификации выловленных рыб при внедрении в аквакультуру [3].
Метод молекулярного тестирования по гипервариабельным локусам генома широко используется для выявления видовой и внутривидовой генетической изменчивости, идентификации популяций, пород, типов и линий животных вплоть до индивидуального генотипирования [4–7].
Цель исследования – подтверждение видовой принадлежности гольцов, обитающих в озере Мелкое.
Задачи: вылов гольцов в оз. Мелкое; взятие биоматериала для ПЦР-теста; определение фрагментов ДНК, характерных для вида.
Материалы и методы. Отлов гольцов проводился на оз. Мелкое бассейна реки Пясины в сентябре-октябре 2022 г. (рис. 2). Отлавливали ставными жилковыми сетями ячеей 30–55 мм, длиной 30 м и высотой в посадке 2 м на глубинах от 9 до 14 м. Время экспозиции 12 ч. Температура воды – 6–7 °С.
Рис. 2. Географическое положение озера Мелкое
Для проб был взят биоматериал (мышцы хребта) в количестве семи образцов (в двух повторностях), его фиксировали в 95 %-м этаноле. Исследование биоматериала было проведено в г. Красноярске в лаборатории определения качества молока и иммуногенетики АО «Красноярскагроплем».
Перед выделением ДНК мышечную ткань вымачивали в буферном растворе трис-гидрохлорида. Для выделения ДНК из образцов был использован набор реагентов «Экстран-2» производства фирмы ООО «НПФ Синтол», Россия. В протокол выделения входило: 1) внесение образцов; 2) лизис клеток; 3) осаждение белков; 4) осаждение ДНК; 5) промывка и растворение ДНК. Хранили выделенную ядерную ДНК при температуре минус 20 °С.
При проведении ISSR-анализа был использован ряд олигонуклеотидных праймеров (затравок) для синтеза фрагментов ДНК. Праймеры представляли собой различные последовательности микросателлитов:
- (CTC)6G – CTC-CTC-CTC-CTC-CTC-CTC-G;
- (AGC)6G – AGC-AGC-AGC-AGC-AGC-AGC-G;
- (GAG)6C – GAG-GAG-GAG-GAG-GAG-GAG-C;
- (ACC)6G – ACC-ACC-ACC-ACC-ACC-ACC-G.
Были поставлены четыре варианта реакций ПЦР. В реакционную смесь добавляли один из вышеуказанных олигонуклеотидов, который служил в качестве прямого и обратного (инвертированного) праймера. В каждом случае были обнаружены в геноме и синтезированы локусы ДНК, находящиеся между указанными микросателлитными последовательностями.
ПЦР проводили в режиме горячий старт – 3 мин/95 °С. Далее 35 циклов в режиме: денатурация – 1 мин/94 °С; отжиг праймеров – 1 мин/60 °С; синтез ДНК –1 мин/72 °С; достройка – 5 мин/72 °С.
В результате ПЦР было амплифицировано большое число фрагментов. Разделение продуктов амплификации ДНК проводили в 2,5 % агарозном геле в присутствии интеркалирующего флуоресцентного красителя этидиум бромида (C21H20BrN3). Результаты реакции визуализировали в УФ-свете с использованием тест-системы «Bio-Rad» и документировали в электронном виде. Межмикросателлитные локусы ДНК представлены на электрофореграмме дискретными полосами (ISSR-фингерпринтинг). Длины фрагментов рассчитывали с помощью компьютерного анализа с использованием программы «MS Excel» и маркера длин ДНК 100 bp + 1,5 Kb + 3 Kb (НПО «Сибэнзим») в качестве референта.
Результаты и их обсуждение. Методом ПЦР с использованием микросателлитных праймеров (СТС)6G, (AGC)6G, (GAG)6C, (ACC)6G были исследованы пробы мышечной ткани семи особей гольца. По результатам электрофоретического разделения фрагментов в агарозном геле наибольшее количество фрагментов ДНК было получено с использованием микросателлитного тринуклеотидного праймера (AGC)6G.
В результате генетического анализа с помощью праймера (AGC)6G у семи особей были зарегистрированы на электронных снимках всего 35 фрагментов длиной от 200 до 2000 п.н., визуально различимых и формирующих выраженные пики при компьютерном сканировании гелей (рис. 3).
Рис. 3. Межмикросателлитные фрагменты ДНК гольца (на дорожке 8 (справа)
находится маркер длин ДНК 100 bp + 1,5 Kb + 3 Kb (НПО «Сибэнзим»)
Во всех образцах встречаются семь маркерных фрагментов ДНК длиной от 200 до 1000 п.н. Распределение длин маркерных фрагментов приведено в таблице.
Распределение длин маркерных ISSR-фрагментов ДНК у гольца
|
Интервал длин фрагментов |
Количество фрагментов |
Длина фрагментов |
|
1000–1100 |
1 |
1050 |
|
700–600 |
2 |
660,700 |
|
500–400 |
1 |
450 |
|
200–300 |
3 |
200, 260, 300 |
Распределение длин и частота встречаемости фрагментов ДНК являются характеристикой генома гольца.
Заключение. Для получения ISSR-фрагментов ДНК были использованы микросателлитные инвертированные праймеры, которые позволяют амплифицировать участки ДНК, расположенные между микросателлитными повторами. Метод анализа полиморфизма межмикросателлитных участков ДНК, основанный на полимеразной цепной реакции, позволил охарактеризовать множественные локусы генома гольца.
Полученные результаты молекулярно-генетического анализа представленных образцов мышечной ткани хребта гольцов свидетельствуют о том, что распределение длин и частота встречаемости фрагментов ДНК являются характерными признаками генома гольца.
Специфическими для гольца Дрягина являются фрагменты ДНК длиной от 200 до 1050 п.н.
Полученные результаты будут использованы для определения видовой систематической принадлежности гольца при внедрении в аквакультуру Красноярского края.
1. Geneticheskaya struktura populyaciy severnyh oleney o. Kolguev Neneckogo avtonomnogo okruga / T.M. Romanenko [i dr.] // Dostizhenie nauki i tehniki APK. 2014. №. 4. S. 68–70.
2. Golec Dryagina Salvelinus Drjagini Logaschev ozera Sobach'ego (plato Putorana) / V.A. Zadelenov [i dr.] // Rybolovstvo i rybnoe hozyaystvo. 2022. № 10. S. 661–672.
3. Zhvakina A.R., El'sukova I.A., Legkobit A.P. Analiz allelofonda krolikov otechestvennyh porod metodom ISSR-PCR // Dostizhenie nauki i tehniki APK. 2016. T. 30, № 1. S. 72–74.
4. Kol N.V., Lazebnyy O.E. Polimorfizm ISSR-PCR-markerov v tuvinskoy populyacii severnogo olenya // Genetika. 2006. T. 42. S. 1731–1734.
5. Logashev M.V. Ozero Melkoe i ego rybohozyaystvennoe ispol'zovanie // Tr. Instituta polyarnogo zemledeliya, zhivotnovodstva i promyslovogo hozyaystva. Ser. Promyslovoe hozyaystvo. 1940. № 11. S. 7–72.
6. Timoshkina N.N., Vodolazhskiy D.I., Usatov A.V. Molekulyarno-geneticheskie markery v issledovanii vnutri- i mezhvidovogo polimorfizma osetrovyh ryb (Acipenseriformes) // Ekologicheskaya genetika. 2010. T. 8. №. 1. S. 12–24.
7. Hartley S.E., Davidson W.S. Distribution of satellite DNA sequences isolated from Arctic char, Salvelinus alpinus, in the genus Salvelinus // Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 1994. T. 51, № S1. S. 277–283.
