Russian Federation
Institut lesa im. V.N. Sukacheva SO RAN
Institut lesa im. V.N. Sukacheva SO RAN
FIC Krasnoyarskiy nauchnyy centr SO RAN
The purpose of the work is to study the phytopathogenicity of Siberian strains of fusarium fungi (Fusarium, Neocosmospora) associated with grain crops, and their intraspecific heterogeneity in pathogenic properties. Highly toxic species have been identified F. sporotrichioides and F. oxysporum, the metabolites of which reduce the average laboratory germination of Triticumaestivum and Larixsibirica seeds by 50 % or more compared to the control. The species F. sporotrichioides and F. fujikuroi SC inhibit the development of the stem and root of wheat to an equal extent; N. solani and F. oxysporum suppress the root system to a greater extent. Intraspecific differences in the degree of phytotoxicity in relation to Zeamays seedlings and the dynamics of accumulation of metabolites for the species F. sporotrichioides, F. avenaceum, F. oxysporum, N. solani and F. fujikuroi SC are shown. Average root growth inhibition rates range from 52 to 89 %. For all strains, the phytotoxic effect increased (up to 98 %) with increasing cultivation time (14 days or more). The level of synthesis of T-2 fusariotoxin was studied for the most common species in the region, F. sporotrichioides. The maximum concentration (5.3–5.5 mg/kg) was observed in a strain isolated from barley and its monosporous crops; the toxin concentration in monoconidial clones varied from 0.94 to 5.4 mg/kg. The level of toxin synthesis in strains isolated from wheat was 0.05–0.84 mg/kg. The heterogeneity of F.sporotrichioides in terms of phytopathogenic properties was revealed: the studied strains inhibit the development of wheat within a wide range (by 36–79 % compared to the control) with the formation of necrosis with an intensity of up to 1.6 points. Monoconidial lines of F.sporotrichioides were identified, differing from the natural isolate in phytopathogenicity, mainly in the direction of its increase (growth inhibition up to 95%, necrosis up to 2.6 points).
phytopathogenicity, phytotoxicity, fusarium fungi, necrosis, laboratory germination, seedlings, Fusarium, Neocosmospora
Введение. Фузариоидные грибы (род Fusarium sensu stricto и близкородственные рода) являются значимыми фитопатогенами зерновых культур и встречаются во всех зерносеющих регионах. Они вызывают заболевания различных органов у широкого круга растений-хозяев, накапливаются в сельскохозяйственной продукции и контаминируют ее микотоксинами. Заболевания могут протекать бессимптомно (при заражении растения видами F. poae, F. Sporotrichioides и F. tricinctum) либо с видимыми проявлениями в виде окрашенного спороношения (F. avenaceum, F. culmorum, F. graminearum). Патологическое действие фузариоидных грибов на растение определяется наличием и степенью проявления факторов фитопатогенности, которые существенно варьируют у различных видов и популяций. Внутривидовой полиморфизм фитопатогенных грибов и влияние почвенно-климатических условий способствуют отбору экологически пластичных и патогенных популяций, которые доминируют в структуре фитопатогенного комплекса и вытесняют виды с невысокой встречаемостью [1–5].
Цель исследования – изучение внутривидовой гетерогенности по фитопатогенным свойствам у сибирских штаммов фузариоидных грибов.
Задачи: определить фитотоксические свойства метаболитов грибов на семенах и проростках лиственницы и пшеницы; исследовать динамику фитотоксической активности на проростках кукурузы у наиболее активных штаммов; оценить гетерогенность по фитопатогенным свойствам у доминирующего в регионе вида.
Объекты и методы. Объектами исследования служили 52 изолята фузариоидных грибов (Fusarium, Neocosmospora) из коллекции лаборатории лесных культур, микологии и фитопатологии Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН. Грибы изолировали в чистую культуру из образцов Triticum aestivum L. и Hordeum vulgare L. с признаками заболевания (колос, зерновки, стебель, корни). Первичную идентификацию осуществляли на основании культурально-морфологических признаков [6–10], с обязательной молекулярно-генетической верификацией – секвенирование ДНК гена фактора элонгации трансляции (TEF-1α) и второй по величине субъединицы РНК-полимеразы (RPB2) [10]. На рисунке 1 представлено филогенетическое дерево, построенное на основании нуклеотидных последовательностей 31 изолята F. sporotrichioides, включая 1 новый сибирский штамм [11], секвенированных по одному локусу. Последовательности выровнены по таксону Atractium stilbaster [10].
Фитопатогенные свойства оценивали по модифицированной методике Челковского-Манки на проростках пшеницы сорта Красноярская-12. Исследуемые штаммы высевали на картофельно-сахарозный агар (КСА) в чашки Петри и культивировали их в течение пяти суток при 24 °С в темноте. Семена поверхностно стерилизовали 70 % этанолом в течение 3 мин и замачивали в стерильной воде на 24 ч при 24 °С для набухания. На мицелий гриба раскладывали набухшие семена в количестве 10 штук в трехкратной повторности, контролем служили семена, разложенные на поверхности стерильного КСА. Чашки в течение 7 сут выдерживали в темноте при 24 °С, после чего измеряли длину появившихся ростков (мм) и регистрировали степень их поражения по четырехбалльной шкале: 0 баллов – здоровый росток; 1 балл – точечный некроз ткани; 2 балла – некроз около 50 % площади ткани; 3 балла – гибель.
Биотестирование метаболитов проводили на семенах пшеницы сорта Тулунская-12, Larix sibirica Ledeb. и проростках Zea mays L. сорта Лакомка [6]. Иммуноферментный анализ Т2 фузариотоксина проводили стандартным методом (ГОСТ Р 52471-2005) на базе Краевой ветеринарной лаборатории. Культуры грибов выращивали на стерильном рисе в течение 10 сут при 25 °С.
Рис. 1. Филогенетическое дерево на основе метода максимального правдоподобия (ML) для штамма F30 и последовательностей Fusarium sporotrichioides из NCBI GenBank
с использованием праймеров TEF-1α. Бутстреп-значения более 50 % указаны рядом
с кластерами. В качестве внешней группы использовали Atractium stilbaster (Link)
Результаты и их обсуждение. На первом этапе провели оценку влияния метаболитов фузариоидных грибов на токсигенной среде. Установлено, что уровень фитотоксичности варьирует в пределах вида и между отдельными видами по показателям лабораторной всхожести семян пшеницы и лиственницы (табл. 1). В группу высокотоксичных отнесены виды Fusarium sporotrichioides Sherb. и Fusarium oxysporum Schltdl. – средний показатель всхожести семян в пределах каждого вида был ниже контрольного значения на 50 % и более. Группу умеренно токсичных образуют виды Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc., Neocosmospora solani (Mart.) L. Lombard & Crous и неидентифицированные изоляты из комплекса F. fujikuroi: пределы варьирования лабораторной всхожести составили 27,1–64,1 %. Семена пшеницы оказались более чувствительными к метаболитам Fusarium poae (Peck) Wollenw., Fusarium acuminatum Ellis & Everh. и Fusarium culmorum (Wm.G. Sm.) по сравнению с лиственницей сибирской.
Таблица 1
Лабораторная всхожесть семян злаковых и хвойных растений
под действием метаболитов сибирских штаммов рода Fusarium
|
Комплекс видов / вид |
Количество штаммов |
Лабораторная всхожесть семян, % от контроля* |
|
|
Triticum L. |
Larix sibirica |
||
|
Fusarium sambucinum species complex |
|||
|
F. sambucinum |
4 |
64,5–103,7** |
61,3–101,2 |
|
F. sporotrichioides |
12 |
14,2–51,4 |
17,9–54,1 |
|
F. poae |
4 |
47,9–74,1 |
69,1–92,3 |
|
5 |
29,5–64,1 |
49,8–78,1 |
|
|
Fusarium tricinctum species complex |
|||
|
F. acuminatum |
6 |
43,1–75,4 |
57,7–82,3 |
|
8 |
27,3–58,4 |
30,9–63,3 |
|
|
Fusarium oxysporum species complex |
|||
|
F. oxysporum |
5 |
19,4–54,2 |
16,9–57,3 |
|
Fusarium fujikuroi species complex |
|||
|
Fusarium sp. |
4 |
29,3–61,3 |
25,5–64,2 |
|
Neocosmospora |
|||
|
N. solani |
4 |
27,1–63,5 |
24,2–68,1 |
*Всхожесть семян в контроле в расчетах принята за 100 %; 0–30 % – высокая степень фитотоксичности; 30–70 % – средняя; более 70 % – слабая.
**Минимальное и максимальное значения в пределах выборки.
Пролонгированный фитотоксический эффект проявился в ингибировании развития стебля и корня (рис. 2). На семисуточных проростках пшеницы ингибирование роста стебля варьировало от 3 до 46 %, главного корня – от 2 до 73 % относительно контроля. Максимальная фитотоксичность характерна для изолятов F. sporotrichioides. Штаммы F. sporotrichioides и F. fujikuroi SC угнетали развитие в равной степени стебля и корня; N. solani и F. oxysporum сильнее ингибировали корневую систему. На 14-суточных проростках L. sibirica ингибирование роста стебля составило от 8 до 63 %, корневой системы – от 14 до 75 %. Максимальной токсигенностью обладали метаболиты F.oxysporum, F. avenaceum, N. solani, F. sporotrichioides и F. fujikuroi SC.
Динамику фитотоксической активности исследовали на двухсуточных проростках Z. mays, используя фильтраты фитотоксичных культур, полученные на токсигенной среде в течение 49 сут (рис. 3).
Для всех исследуемых штаммов характерна высокая фитотоксичность – средние показатели ингибирования роста корней варьировали от 52 до 89 %. Выявлены внутривидовые различия по степени фитотоксической активности и динамике накопления метаболитов. Например, штаммы F. sporotrichioides были разделены на три группы. Штаммы первой группы (50 % исследованных культур) оказывали сильное фитотоксическое действие (более 50 % ингибирования роста) в течение всего периода с постепенным увеличением фитотоксичности до 79–98 %. Штаммы из второй группы (30 %) проявили сначала умеренное фитотоксическое действие (10–25 %), а затем выраженное (39–81 %). Третья группа (20 %) представлена штаммами, которые в начальный период стимулировали развитие корней, но затем отмечено существенное ингибирование (58–87 %). Внутривидовая гетерогенность по фитотоксичности также выявлена у F. avenaceum (ингибирование роста корней 38–74 %), F. Oxysporum (47–98 %), N. solani (58–83 %) и F. fujikuroi SC (44–98 %).
Рис. 2. Морфометрические показатели проростков Triticum aestivum
под влиянием метаболитов сибирских штаммов фузариоидных грибов
Рис. 3. Динамика фитотоксической активности сибирских штаммов
фузариоидных грибов в отношении корней Zea mays
Для изолятов вида F. sporotrichioides, как наиболее распространенного на исследуемой территории [11], был проведен иммуноферментный анализ на наличие Т2-фузариотоксина. Токсин выявлен во всех исследуемых культурах, однако его концентрация варьировала между отдельными штаммами в пределах вида и среди моноспоровых культур одного штамма (табл. 2).
Максимальная концентрация Т-2 фузариотоксина отмечена для штамма Fs11, выделенного из зерновок ячменя. Содержание микотоксина у его моноспоровых культур соответствовало уровню родительского штамма (5,3–5,4 мг/кг) либо было существенно ниже (0,94–2,74 мг/кг). Уровень синтеза токсинов у штаммов, выделенных из зерновок пшеницы, был меньше и находился в пределах 0,05–0,84 мг/кг.
Таблица 2
Содержание Т-2 фузариотоксина в культурах Fusarium sporotrichioides,
выращенных на рисовом зерне
|
Штамм |
Источник выделения |
Концентрация токсина (мг/кг), Х ср. ± m |
|
Fs11 |
Зерновки ячменя сорта Ача |
5,50±0,89 |
|
Fs11-3 |
Моноспоровые культуры штамма Fs11 |
5,40±0,87 |
|
Fs11-9 |
5,30±0,86 |
|
|
Fs11-10 |
2,74±0,44 |
|
|
Fs11-4 |
0,94±0,15 |
|
|
Z11-1 |
Зерновки пшеницы, сорт Тулунская-12 |
0,84±0,14 |
|
Z31-5 |
Зерновки пшеницы, сорт Красноярская-12 |
0,81±0,13 |
|
Z37-1 |
Зерновки пшеницы, селекционная линия «К64-2» |
0,14±0,02 |
|
Z12 |
Зерновки пшеницы, сорт Мана-2 |
0,05±0,014 |
На следующем этапе оценивали фитопатогенные свойства живых культур F. Sporotrichioides. Исследование проводили на проростках пшеницы сорта Красноярская-12, оценивая длину проростка (патогенность) и наличие некроза корней (агрессивность) по сравнению с контролем. Все исследуемые штаммы достоверно ингибировали развитие проростков по сравнению с контролем: 70 % штаммов снижали длину на 50–79 % (средний показатель группы 67 %); 30 % штаммов – в диапазоне 36–49 % (средний показатель 43 %) (рис. 4). Отмечено наличие некроза в тканях с максимумом до 1,6 балла (по трехбалльной шкале); при этом более чем у 50 % культур степень некроза составила 0,9–1,6 балла.
Для токсигенного штамма Fs11 F. Sporotrichioides получены 16 моноконидиальных культур, фитопатогенность которых исследовали аналогичными методами. Установлено, что у 81 % клонов показатели фитопатогенности выше, чем у родительского штамма, длина проростков уменьшилась на 84–95 % по сравнению с контролем. Более 50 % клонов вызывали некрозы корней от 1,8 до 2,6 балла, что превышает исходный показатель в среднем в 1,6 раза. У 19 % моноспоровых культур показатели патогенности достоверно не отличаются от родительского штамма.
Рис. 4. Фитопатогенность сибирских штаммов Fusarium sporotrichioides
на проростках Triticum aestivum
Заключение. Сибирские штаммы фузариоидных грибов в различной степени ингибируют лабораторную всхожесть семян и замедляют ростовые процессы злаковых и хвойных растений. Максимальная фитотоксичность отмечена для видов F. sporotrichioides и F. oxysporum, в меньшей степени фитотоксичны F.avenaceum, N. solani и неидентифицированные изоляты F. fujikuroi SC. Выявлены внутривидовые различия по динамике накопления метаболитов и фитотоксичности в отношении проростков Z. mays для видов F.sporotrichioides, F. avenaceum, F. oxysporum, N.solani и F. fujikuroi SC, при этом для всех штаммов фитотоксический эффект возрастал (до 98 %) при увеличении времени культивирования.
Максимальная концентрация Т-2 фузариотоксина (до 5,5 мг/кг) отмечена у штамма F. sporotrichioides, выделенного из ячменя, и его моноспоровых культур, при этом содержание токсина у клонов существенно варьировало (0,94–5,4 мг/кг). Уровень синтеза токсина у остальных штаммов был ниже и составил 0,05–0,84 мг/кг.
Выявлена внутривидовая гетерогенность F. sporotrichioides по фитопатогенности: при моноконидиальном рассеве выщепляются линии, отличные от природного штамма, преимущественно в сторону увеличения патогенности, что указывает на микроклональную структуру популяции по токсикогенным свойствам и свидетельствует о вероятности появления более агрессивных клонов.
1. Bilay V.I. Fuzarii. Kiev: Naukova dumka, 1977. 443 s.
2. Fuzarioz zernovyh kul'tur / T.Yu. Gagkaeva [i dr.] // Prilozhenie k zhurnalu «Zaschita i karantin rasteniy». 2011. № 5. S. 70–112.
3. Ivaschenko V.G., Buchneva G.N., Shipilova N.P. Griby roda Fusarium na pshenice v Central'no-Chernozemnom regione Rossii: rasprostranennost' i formy proyavleniya bolezney // Mikologiya i fitopatologiya. 2007. T. 41, № 6. S. 546–553.
4. Sheshegova T.K. Fuzarioz kolosa i zerna ozimoy rzhi // Zaschita i karantin rasteniy. 2003. № 4. S. 50–51.
5. D'yakov Yu.T. Populyacionnaya biologiya fitopatogennyh gribov. M.: Muravey, 1998. 382 s.
6. Metody eksperimental'noy mikologii / pod red. V.I. Bilay. Kiev: Naukova dumka, 1982. 550 s.
7. Methods for research on soil borne phytopathogenic fungi / edited by L.L. Singleton, J.D. Mihail, C.M. Rush. St. Paul, Minnesota: APS Press, 1992. 264 p.
8. Nelson P.E., Toussoun T.A., Marasas W.F.O. Fusarium species: an illustrated manual for identifications. The Pennsylvania State University Press, 1983. 193 p.
9. Leslie J.F., Summerell B.A. The Fusarium laboratory manual. USA: Blackwell Publishing, 2006. 388 p.
10. Fusarium: more than a node or a foot-shaped basal cell / P.W. Crous [et al.] // Studies in Mycology. 2021. 98: 100116.
11. Litovka Yu.A. Vidovoy sostav i predstavlennost' gribov roda Fusarium na zernovyh kul'turah (pshenica i yachmen'), vyraschivaemyh v usloviyah Sredney Sibiri // Vestnik KrasGAU. 2017. № 6 (129). S. 140–149.
