Россия
Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН
Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН
ФИЦ Красноярский научный центр СО РАН
Цель работы – исследование фитопатогенности сибирских штаммов фузариоидных грибов (Fusarium, Neocosmospora), ассоциированных с зерновыми культурами, и их внутривидовой гетерогенности по патогенным свойствам. Выявлены высокотоксичные виды F. sporotrichioides и F. oxysporum, метаболиты которых снижают средний показатель лабораторной всхожести семян Triticum aestivum и Larix sibirica на 50 % и более по сравнению с контролем. Виды F. sporotrichioides и F. fujikuroi SC ингибируют развитие в равной степени стебля и корня пшеницы; N. solani и F. oxysporum угнетают в большей степени корневую систему. Показаны внутривидовые различия по степени фитотоксичности в отношении проростков Zeamays и динамике накопления метаболитов для видов F. sporotrichioides, F. avenaceum, F. oxysporum, N. solani и F. fujikuroi SC. Средние показатели ингибирования роста корней варьируют от 52 до 89 %. Для всех штаммов установлено нарастание фитотоксического эффекта (до 98 %) при увеличении времени культивирования (14 суток и более). Исследован уровень синтеза Т-2 фузариотоксина для наиболее распространенного в регионе вида F.sporotrichioides. Максимальная концентрация (5,3–5,5 мг/кг) отмечена у штамма, выделенного из ячменя и его моноспоровых культур; концентрация токсина у моноконидиальных клонов варьировала от 0,94 до 5,4 мг/кг. Уровень синтеза токсина у штаммов, выделенных из пшеницы, составил 0,05–0,84 мг/кг. Выявлена гетерогенность F. sporotrichioides по фитопатогенным свойствам: исследуемые штаммы ингибируют развитие пшеницы в широких пределах (на 36–79 % по сравнению с контролем) с формированием некрозов интенсивностью до 1,6 балла. Выявлены моноконидиальные линии F. sporotrichioides, отличные от природного изолята по фитопатогенности, преимущественно в сторону ее увеличения (ингибирование роста до 95 %, некроз до 2,6 баллов).
фитопатогенность, фитотоксичность, фузариоидные грибы, некроз, лабораторная всхожесть, проростки, Fusarium, Neocosmospora
Введение. Фузариоидные грибы (род Fusarium sensu stricto и близкородственные рода) являются значимыми фитопатогенами зерновых культур и встречаются во всех зерносеющих регионах. Они вызывают заболевания различных органов у широкого круга растений-хозяев, накапливаются в сельскохозяйственной продукции и контаминируют ее микотоксинами. Заболевания могут протекать бессимптомно (при заражении растения видами F. poae, F. Sporotrichioides и F. tricinctum) либо с видимыми проявлениями в виде окрашенного спороношения (F. avenaceum, F. culmorum, F. graminearum). Патологическое действие фузариоидных грибов на растение определяется наличием и степенью проявления факторов фитопатогенности, которые существенно варьируют у различных видов и популяций. Внутривидовой полиморфизм фитопатогенных грибов и влияние почвенно-климатических условий способствуют отбору экологически пластичных и патогенных популяций, которые доминируют в структуре фитопатогенного комплекса и вытесняют виды с невысокой встречаемостью [1–5].
Цель исследования – изучение внутривидовой гетерогенности по фитопатогенным свойствам у сибирских штаммов фузариоидных грибов.
Задачи: определить фитотоксические свойства метаболитов грибов на семенах и проростках лиственницы и пшеницы; исследовать динамику фитотоксической активности на проростках кукурузы у наиболее активных штаммов; оценить гетерогенность по фитопатогенным свойствам у доминирующего в регионе вида.
Объекты и методы. Объектами исследования служили 52 изолята фузариоидных грибов (Fusarium, Neocosmospora) из коллекции лаборатории лесных культур, микологии и фитопатологии Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН. Грибы изолировали в чистую культуру из образцов Triticum aestivum L. и Hordeum vulgare L. с признаками заболевания (колос, зерновки, стебель, корни). Первичную идентификацию осуществляли на основании культурально-морфологических признаков [6–10], с обязательной молекулярно-генетической верификацией – секвенирование ДНК гена фактора элонгации трансляции (TEF-1α) и второй по величине субъединицы РНК-полимеразы (RPB2) [10]. На рисунке 1 представлено филогенетическое дерево, построенное на основании нуклеотидных последовательностей 31 изолята F. sporotrichioides, включая 1 новый сибирский штамм [11], секвенированных по одному локусу. Последовательности выровнены по таксону Atractium stilbaster [10].
Фитопатогенные свойства оценивали по модифицированной методике Челковского-Манки на проростках пшеницы сорта Красноярская-12. Исследуемые штаммы высевали на картофельно-сахарозный агар (КСА) в чашки Петри и культивировали их в течение пяти суток при 24 °С в темноте. Семена поверхностно стерилизовали 70 % этанолом в течение 3 мин и замачивали в стерильной воде на 24 ч при 24 °С для набухания. На мицелий гриба раскладывали набухшие семена в количестве 10 штук в трехкратной повторности, контролем служили семена, разложенные на поверхности стерильного КСА. Чашки в течение 7 сут выдерживали в темноте при 24 °С, после чего измеряли длину появившихся ростков (мм) и регистрировали степень их поражения по четырехбалльной шкале: 0 баллов – здоровый росток; 1 балл – точечный некроз ткани; 2 балла – некроз около 50 % площади ткани; 3 балла – гибель.
Биотестирование метаболитов проводили на семенах пшеницы сорта Тулунская-12, Larix sibirica Ledeb. и проростках Zea mays L. сорта Лакомка [6]. Иммуноферментный анализ Т2 фузариотоксина проводили стандартным методом (ГОСТ Р 52471-2005) на базе Краевой ветеринарной лаборатории. Культуры грибов выращивали на стерильном рисе в течение 10 сут при 25 °С.
Рис. 1. Филогенетическое дерево на основе метода максимального правдоподобия (ML) для штамма F30 и последовательностей Fusarium sporotrichioides из NCBI GenBank
с использованием праймеров TEF-1α. Бутстреп-значения более 50 % указаны рядом
с кластерами. В качестве внешней группы использовали Atractium stilbaster (Link)
Результаты и их обсуждение. На первом этапе провели оценку влияния метаболитов фузариоидных грибов на токсигенной среде. Установлено, что уровень фитотоксичности варьирует в пределах вида и между отдельными видами по показателям лабораторной всхожести семян пшеницы и лиственницы (табл. 1). В группу высокотоксичных отнесены виды Fusarium sporotrichioides Sherb. и Fusarium oxysporum Schltdl. – средний показатель всхожести семян в пределах каждого вида был ниже контрольного значения на 50 % и более. Группу умеренно токсичных образуют виды Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc., Neocosmospora solani (Mart.) L. Lombard & Crous и неидентифицированные изоляты из комплекса F. fujikuroi: пределы варьирования лабораторной всхожести составили 27,1–64,1 %. Семена пшеницы оказались более чувствительными к метаболитам Fusarium poae (Peck) Wollenw., Fusarium acuminatum Ellis & Everh. и Fusarium culmorum (Wm.G. Sm.) по сравнению с лиственницей сибирской.
Таблица 1
Лабораторная всхожесть семян злаковых и хвойных растений
под действием метаболитов сибирских штаммов рода Fusarium
|
Комплекс видов / вид |
Количество штаммов |
Лабораторная всхожесть семян, % от контроля* |
|
|
Triticum L. |
Larix sibirica |
||
|
Fusarium sambucinum species complex |
|||
|
F. sambucinum |
4 |
64,5–103,7** |
61,3–101,2 |
|
F. sporotrichioides |
12 |
14,2–51,4 |
17,9–54,1 |
|
F. poae |
4 |
47,9–74,1 |
69,1–92,3 |
|
5 |
29,5–64,1 |
49,8–78,1 |
|
|
Fusarium tricinctum species complex |
|||
|
F. acuminatum |
6 |
43,1–75,4 |
57,7–82,3 |
|
8 |
27,3–58,4 |
30,9–63,3 |
|
|
Fusarium oxysporum species complex |
|||
|
F. oxysporum |
5 |
19,4–54,2 |
16,9–57,3 |
|
Fusarium fujikuroi species complex |
|||
|
Fusarium sp. |
4 |
29,3–61,3 |
25,5–64,2 |
|
Neocosmospora |
|||
|
N. solani |
4 |
27,1–63,5 |
24,2–68,1 |
*Всхожесть семян в контроле в расчетах принята за 100 %; 0–30 % – высокая степень фитотоксичности; 30–70 % – средняя; более 70 % – слабая.
**Минимальное и максимальное значения в пределах выборки.
Пролонгированный фитотоксический эффект проявился в ингибировании развития стебля и корня (рис. 2). На семисуточных проростках пшеницы ингибирование роста стебля варьировало от 3 до 46 %, главного корня – от 2 до 73 % относительно контроля. Максимальная фитотоксичность характерна для изолятов F. sporotrichioides. Штаммы F. sporotrichioides и F. fujikuroi SC угнетали развитие в равной степени стебля и корня; N. solani и F. oxysporum сильнее ингибировали корневую систему. На 14-суточных проростках L. sibirica ингибирование роста стебля составило от 8 до 63 %, корневой системы – от 14 до 75 %. Максимальной токсигенностью обладали метаболиты F.oxysporum, F. avenaceum, N. solani, F. sporotrichioides и F. fujikuroi SC.
Динамику фитотоксической активности исследовали на двухсуточных проростках Z. mays, используя фильтраты фитотоксичных культур, полученные на токсигенной среде в течение 49 сут (рис. 3).
Для всех исследуемых штаммов характерна высокая фитотоксичность – средние показатели ингибирования роста корней варьировали от 52 до 89 %. Выявлены внутривидовые различия по степени фитотоксической активности и динамике накопления метаболитов. Например, штаммы F. sporotrichioides были разделены на три группы. Штаммы первой группы (50 % исследованных культур) оказывали сильное фитотоксическое действие (более 50 % ингибирования роста) в течение всего периода с постепенным увеличением фитотоксичности до 79–98 %. Штаммы из второй группы (30 %) проявили сначала умеренное фитотоксическое действие (10–25 %), а затем выраженное (39–81 %). Третья группа (20 %) представлена штаммами, которые в начальный период стимулировали развитие корней, но затем отмечено существенное ингибирование (58–87 %). Внутривидовая гетерогенность по фитотоксичности также выявлена у F. avenaceum (ингибирование роста корней 38–74 %), F. Oxysporum (47–98 %), N. solani (58–83 %) и F. fujikuroi SC (44–98 %).
Рис. 2. Морфометрические показатели проростков Triticum aestivum
под влиянием метаболитов сибирских штаммов фузариоидных грибов
Рис. 3. Динамика фитотоксической активности сибирских штаммов
фузариоидных грибов в отношении корней Zea mays
Для изолятов вида F. sporotrichioides, как наиболее распространенного на исследуемой территории [11], был проведен иммуноферментный анализ на наличие Т2-фузариотоксина. Токсин выявлен во всех исследуемых культурах, однако его концентрация варьировала между отдельными штаммами в пределах вида и среди моноспоровых культур одного штамма (табл. 2).
Максимальная концентрация Т-2 фузариотоксина отмечена для штамма Fs11, выделенного из зерновок ячменя. Содержание микотоксина у его моноспоровых культур соответствовало уровню родительского штамма (5,3–5,4 мг/кг) либо было существенно ниже (0,94–2,74 мг/кг). Уровень синтеза токсинов у штаммов, выделенных из зерновок пшеницы, был меньше и находился в пределах 0,05–0,84 мг/кг.
Таблица 2
Содержание Т-2 фузариотоксина в культурах Fusarium sporotrichioides,
выращенных на рисовом зерне
|
Штамм |
Источник выделения |
Концентрация токсина (мг/кг), Х ср. ± m |
|
Fs11 |
Зерновки ячменя сорта Ача |
5,50±0,89 |
|
Fs11-3 |
Моноспоровые культуры штамма Fs11 |
5,40±0,87 |
|
Fs11-9 |
5,30±0,86 |
|
|
Fs11-10 |
2,74±0,44 |
|
|
Fs11-4 |
0,94±0,15 |
|
|
Z11-1 |
Зерновки пшеницы, сорт Тулунская-12 |
0,84±0,14 |
|
Z31-5 |
Зерновки пшеницы, сорт Красноярская-12 |
0,81±0,13 |
|
Z37-1 |
Зерновки пшеницы, селекционная линия «К64-2» |
0,14±0,02 |
|
Z12 |
Зерновки пшеницы, сорт Мана-2 |
0,05±0,014 |
На следующем этапе оценивали фитопатогенные свойства живых культур F. Sporotrichioides. Исследование проводили на проростках пшеницы сорта Красноярская-12, оценивая длину проростка (патогенность) и наличие некроза корней (агрессивность) по сравнению с контролем. Все исследуемые штаммы достоверно ингибировали развитие проростков по сравнению с контролем: 70 % штаммов снижали длину на 50–79 % (средний показатель группы 67 %); 30 % штаммов – в диапазоне 36–49 % (средний показатель 43 %) (рис. 4). Отмечено наличие некроза в тканях с максимумом до 1,6 балла (по трехбалльной шкале); при этом более чем у 50 % культур степень некроза составила 0,9–1,6 балла.
Для токсигенного штамма Fs11 F. Sporotrichioides получены 16 моноконидиальных культур, фитопатогенность которых исследовали аналогичными методами. Установлено, что у 81 % клонов показатели фитопатогенности выше, чем у родительского штамма, длина проростков уменьшилась на 84–95 % по сравнению с контролем. Более 50 % клонов вызывали некрозы корней от 1,8 до 2,6 балла, что превышает исходный показатель в среднем в 1,6 раза. У 19 % моноспоровых культур показатели патогенности достоверно не отличаются от родительского штамма.
Рис. 4. Фитопатогенность сибирских штаммов Fusarium sporotrichioides
на проростках Triticum aestivum
Заключение. Сибирские штаммы фузариоидных грибов в различной степени ингибируют лабораторную всхожесть семян и замедляют ростовые процессы злаковых и хвойных растений. Максимальная фитотоксичность отмечена для видов F. sporotrichioides и F. oxysporum, в меньшей степени фитотоксичны F.avenaceum, N. solani и неидентифицированные изоляты F. fujikuroi SC. Выявлены внутривидовые различия по динамике накопления метаболитов и фитотоксичности в отношении проростков Z. mays для видов F.sporotrichioides, F. avenaceum, F. oxysporum, N.solani и F. fujikuroi SC, при этом для всех штаммов фитотоксический эффект возрастал (до 98 %) при увеличении времени культивирования.
Максимальная концентрация Т-2 фузариотоксина (до 5,5 мг/кг) отмечена у штамма F. sporotrichioides, выделенного из ячменя, и его моноспоровых культур, при этом содержание токсина у клонов существенно варьировало (0,94–5,4 мг/кг). Уровень синтеза токсина у остальных штаммов был ниже и составил 0,05–0,84 мг/кг.
Выявлена внутривидовая гетерогенность F. sporotrichioides по фитопатогенности: при моноконидиальном рассеве выщепляются линии, отличные от природного штамма, преимущественно в сторону увеличения патогенности, что указывает на микроклональную структуру популяции по токсикогенным свойствам и свидетельствует о вероятности появления более агрессивных клонов.
1. Билай В.И. Фузарии. Киев: Наукова думка, 1977. 443 с.
2. Фузариоз зерновых культур / Т.Ю. Гагкаева [и др.] // Приложение к журналу «Защита и карантин растений». 2011. № 5. С. 70–112.
3. Иващенко В.Г., Бучнева Г.Н., Шипилова Н.П. Грибы рода Fusarium на пшенице в Центрально-Черноземном регионе России: распространенность и формы проявления болезней // Микология и фитопатология. 2007. Т. 41, № 6. С. 546–553.
4. Шешегова Т.К. Фузариоз колоса и зерна озимой ржи // Защита и карантин растений. 2003. № 4. С. 50–51.
5. Дьяков Ю.Т. Популяционная биология фитопатогенных грибов. М.: Муравей, 1998. 382 с.
6. Методы экспериментальной микологии / под ред. В.И. Билай. Киев: Наукова думка, 1982. 550 с.
7. Methods for research on soil borne phytopathogenic fungi / edited by L.L. Singleton, J.D. Mihail, C.M. Rush. St. Paul, Minnesota: APS Press, 1992. 264 p.
8. Nelson P.E., Toussoun T.A., Marasas W.F.O. Fusarium species: an illustrated manual for identifications. The Pennsylvania State University Press, 1983. 193 p.
9. Leslie J.F., Summerell B.A. The Fusarium laboratory manual. USA: Blackwell Publishing, 2006. 388 p.
10. Fusarium: more than a node or a foot-shaped basal cell / P.W. Crous [et al.] // Studies in Mycology. 2021. 98: 100116.
11. Литовка Ю.А. Видовой состав и представленность грибов рода Fusarium на зерновых культурах (пшеница и ячмень), выращиваемых в условиях Средней Сибири // Вестник КрасГАУ. 2017. № 6 (129). С. 140–149.
