Russian Federation
Russian Federation
from 01.01.2013 until now
Krasnoyarsk, Krasnoyarsk, Russian Federation
Krasnoyarsk, Krasnoyarsk, Russian Federation
The purpose of the study is to test the possibility of lyophilization of Alternaria tenuissima and Geomyces pannorum strains isolated by the authors as potential amylase producers for the food industry. The conidia of the studied strains were suspended in protective media and lyophilized using a Bio-Rus-4SFD lyophilizer. Three protective media were used: standard gelatin-sucrose agar (sucrose 10 %, gelatin 1.5 %, agar 0.01 %) recommended by the All-Russian Collection of Microorganisms; gelatin-sucrose agar with the addition of 1 % ascorbic acid as an antioxidant; peptone-sucrose-glycerol mixture developed by the authors (distilled water 90 ml, glycerol 10 ml, sucrose 10 g, peptone 3.2 g). Conidia suspended in distilled water without lyoprotectors served as controls. The viability of lyophilized conidia was assessed by their ability to germinate on an agar culture medium. The survival rate of G. pannorum conidia during lyophilization in all variants, except for the control, was statistically significantly (p<0.001) higher than the survival rate of A. tenuissima conidia. The viability of lyophilized A. tenuissima conidia did not depend on the use of protective media and amounted to 75.9 % in the control variant, 76.4 % in the variant with gelatin-sucrose agar, and 77.1 % in the variant with peptone-sucrose-glycerol mixture. The viability of lyophilized G. pannorum conidia without the use of protective media was 82.0 %, in the variant with gelatin-sucrose agar 95.3 %, in the variant with peptone-sucrose-glycerol mixture 88.1 %. The addition of ascorbic acid as an antioxidant to the protective medium led to a statistically significant (p<0.001) decrease in the proportion of A. tenuissima conidia surviving during lyophilization to 7.2 %, and the proportion of G. pannorum conidia surviving to 44.4 %.
amylase, Alternaria tenuissima, Geomyces pannorum, lyophilization, protective media
Введение. Одними из наиболее востребованных ферментов микробного происхождения, применяемых в пищевой и перерабатывающей промышленности, а также в сельском хозяйстве, являются амилазы, на долю которых приходится около 25 % мирового рынка ферментов. Микробные амилазы применяют для конверсии крахмала в олигосахариды и в глюкозу в бродильных и крахмало-паточных производствах, для отбеливания сырья в бумажном и текстильном производствах, в качестве биодобавок к моющим средствам, а также в качестве добавок в крахмалсодержащие корма в птицеводстве и животноводстве для повышения их усвояемости [1–3].
Несмотря на обилие амилолитических штаммов, применяемых в промышленности, постоянно идет поиск новых, в т. ч. нетрадиционных продуцентов микробных амилаз. В качестве одного из перспективных продуцентов амилолитических ферментов рассматриваются грибы р. Alternaria [4–6]. Другим перспективным продуцентом, позволяющим осуществлять процесс при пониженной температуре, являются выделенные из пещер низкотемпературные амилолитические штаммы Geomyces pannorum [7, 8].
Использование штаммов в биотехнологических процессах невозможно без сохранения их исходных вариантов в микробиологических коллекциях. Общепризнанным, наиболее надежным способом такого сохранения считается их сублимационное высушивание из замороженного состояния (лиофилизация) [9, 10]. Главной проблемой при лиофилизации является возможная гибель микробных клеток в процессе замораживания и высушивания. Для решения этой проблемы используют разнообразные эмпирически подбираемые защитные среды, повышающие долю выживших при лиофилизации клеток [11].
Цель исследований – изучение возможности лиофилизации выделенных авторами в ходе предыдущих исследований амилолитических штаммов Alternaria tenuissima К22 и Geomyces pannorum ВКМ F-4777D.
Задачи: проверка возможности сохранения жизнеспособности штаммов при лиофилизации без использования защитных сред, с использованием стандартных защитных сред; выбор защитной среды, обеспечивающей максимальное сохранение жизнеспособности исследуемых штаммов при лиофилизации.
Объекты и методы. Объектами исследования служили выделенные авторами штаммы Alternaria tenuissima К22 и Geomyces pannorum ВКМ F-4777D. Штамм Alternaria tenuissima К22 выделен из инфицированного зерна яровой пшеницы, штамм G. pannorum ВКМ F-4777D выделен из грунта карстовой пещеры Караульная-2 и запатентован в качестве низкотемпературного продуцента амилазы [12]. Оба штамма характеризуются высокой амилолитической активностью (рис. 1).
Конидии изучаемых штаммов суспендировали в одной из защитных сред, после чего лиофилизировали в лиофильной сушилке Bio-Rus-4SFD в следующем режиме: замораживание при –36 °C в течение 5 ч; основная сушка при –40 °C в течение 15 ч при давлении 60 Па; вторичная сушка с шагом от 5 °C до 15 °C при давлении 80 Па в течение 5 ч [13, 14].
Рис. 1. Амилолитическая активность изучаемых штаммов: 1 – A. tenuissima К22; 2 – G. pannorum ВКМ F-4777D
В качестве защитных сред использовали сахарозо-желатиновый агар (среду Файбича) [15, 16], среду Файбича с 1 % аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта [17] и разработанную авторами пептон-сахарозо-глицериновую среду следующего состава: пептон ферментативный сухой – 3,2 г; сахароза – 10 г; глицерин – 10 мл; вода дистиллированная – 90 мл. Контролем служили конидии, суспендированные в дистиллированной воде без добавления лиопротекторов.
Жизнеспособность конидий после лиофилизации определяли прямым методом по их способности к прорастанию на агаризованной питательной среде (рис. 2).
Долю выживших конидий определяли как отношение числа конидий, сформировавших проростковые гифы, к общему числу конидий. Среднее число конидий, просмотренных в каждом варианте на предмет наличия проростковых гиф, составило 168 шт. для A. tenuissima К22 и 282 шт. для G. pannorum ВКМ F-4777D.
Рис. 2. Примеры непроросших (1) и проросших (2) конидий изучаемых штаммов: верхние
фотографии – A. tenuissima К22; нижние фотографии – G. pannorum ВКМ F-4777D
Статистическую значимость различий между контрольным вариантом и вариантами с защитными средами по доле проросших конидий проверяли точным тестом Фишера для таблиц 2 × 2 с использованием GraphPad QuickCalcs в качестве программного обеспечения.
Результаты и их обсуждение. Выживаемость конидий A. tenuissima К22 в контроле (без использования защитной среды) составила 75,9 %. Использование защитной среды Файбича и пептон-сахарозо-глицериновой среды не привело к статистически значимому изменению доли выживших конидий, которая составила 76,4 % для среды Файбича и 77,1 % для пептон-сахарозо-глицериновой среды. Введение аскорбиновой кислоты в среду Файбича привело к статистически значимому (p < 0,001) снижению доли выживших конидий до 7,2 % (рис. 3).
Выживаемость конидий G. pannorum ВКМ F-4777D в контроле (без использования защитной среды) составила 82,0 %. Использование защитной среды Файбича привело к статистически значимому (p < 0,001) увеличению доли выживших конидий до 95,3 %. Пептон-сахарозо-глицериновая среда также статистически значимо (p < 0,05) увеличила долю выживших конидий до 88,1 %. Как и в случае с A. tenuissima К22, введение аскорбиновой кислоты в среду Файбича привело к статистически значимому (p < 0,001) снижению доли выживших конидий G. pannorum ВКМ F-4777D (до 44,4 %) (рис. 4).
Рис. 3. Прорастание лиофилизированных конидий A. tenuissima К22
в разных вариантах эксперимента
Рис. 4. Прорастание лиофилизированных конидий G. pannorum ВКМ F-4777D
в разных вариантах эксперимента
В целом по эксперименту выживаемость конидий G. pannorum при лиофилизации во всех вариантах, за исключением контроля, была статистически значимо (p < 0,001) выше, чем выживаемость конидий A. tenuissima (табл.).
Различия между прорастанием конидий A. tenuissima К22 и G. pannorum ВКМ F-4777D
в разных вариантах эксперимента
|
Вариант защитной среды |
Различие |
Статистическая значимость различий |
||
|
раз |
процентных пунктов |
p двустороннее |
p одностороннее |
|
|
Контроль без лиопротекторов |
1,08 |
6,1 |
0,1320 |
0,0691 |
|
Среда Файбича |
1,25 |
18,9 |
< 0,0001 |
< 0,0001 |
|
Среда Файбича с аскорбиновой кислотой |
6,16 |
37,2 |
< 0,0001 |
< 0,0001 |
|
Пептон-сахарозо-глицериновая среда |
1,14 |
11,0 |
0,0005 |
0,0003 |
Таким образом, A. tenuissima К22 и G. Pannorum ВКМ F-4777D при лиофилизации продемонстрировали хорошую выживаемость конидий, которая даже без использования защитных сред сохраняется на уровне, вполне достаточном для практического использования лиофилизированных культур при хранении этих штаммов.
Заключение
- Оба изученных штамма демонстрируют высокую (75,9 % у A. tenuissima К22 и 82,0 % у G. pannorum ВКМ F-4777D) жизнеспособность конидий после лиофилизации без использования защитных сред.
- Защитные среды не оказывают статистически значимого влияния на выживаемость конидий A. tenuissima К22 и статистически значимо повышают выживаемость конидий G. Pannorum ВКМ F-4777D (в 1,16 раза при использовании среды Файбича и в 1,07 раза при использовании пептон-сахарозо-глицериновой среды).
- Введение в среду Файбича аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта ведет к значительному снижению доли выживших при лиофилизации конидий (в 10,61 раза у A. tenuissima К22 и в 2,15 раза у G. pannorum ВКМ F-4777D).
- На основе полученных результатов можно рекомендовать проведение лиофилизации конидий A. tenuissima К22 без использования защитных сред, а лиофилизацию конидий G. Pannorum ВКМ F-4777D – с использованием защитной среды Файбича либо без использования защитных сред.
1. De Souza P.M. Application of microbial α-amylase in industry – A review // Brazilian Journal of Microbiology. 2010. № 4. P. 850–861.
2. Effects of dietary amylase and sucrose on productivity of cows fed low-starch diets / C.F. Vargas-Rodriguez [et al.] // J. Dairy Sci. 2014. 97(7). P. 4464–4470.
3. Cowieson A.J., Vieira S.L., Stefanello C. Exogenous microbial amylase in the diets of poultry: what do we know? // J. Appl. Poult. Res. 2019. 28 (3). P. 556–565.
4. Shafique S., Bajwa R., Shafique S. Alpha-amylase production by toxigenic fungi // Natural Product Research. 2010. 24(15). P. 1449–1456.
5. Abd A.A., Mostafa, F. Production and Characterization of Fungal α-Amylase from Marine Alternata Utilizing Lignocellulosic Wastes and Its Application // Res. J. Pharm., Biol. Chem. Sci. 2015. 6. P. 813–825.
6. Production of Glucoamylase from Novel Strain of Alternaria Alternata under Solid State Fermentation / D.E. Nayab [et al.] // BioMed Research International. 2022. P. 9. DOI: 10.1155/ 2022/2943790.
7. Hizhnyak S.V., Pampuha V.T. Mikrobnye soobschestva karstovyh pescher kak potencial'nyy istochnik producentov nizkotemperaturnyh amilaz // Vestnik Omskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2016. № 1 (21). S. 104–110.
8. Vliyanie temperatury na skorost' rosta amiloliticheskih shtammov Geomyces pannorum / S.V. Hizhnyak [i dr.] // Vestnik KrasGAU. 2018. № 1 (136). S. 214–221.
9. Adams J. The principles of freeze-drying // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 368. P. 15–38. DOI:https://doi.org/10.1007/978-1-59745-362-2_2.
10. Stacey J.N., Day J. Long-term ex-situ conservation of biological resources and the role of biological resource centers // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 368. P. 1–14. DOI: 10.1007/ 978-1-59745-362-2_1.
11. Gracheva I.V., Osin A.V. Mehanizmy povrezhdeniy bakteriy pri liofilizacii i protektivnoe deystvie zaschitnyh sred // Problemy osobo opasnyh infekciy. 2016. № 3. S. 5–12. DOI:https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-3-5-12.
12. Pat. RU 2736223 C1. Psihrotolerantnyy shtamm micelial'nogo griba Geomyces pannorum VKM F-4777D – producent α-amilazy / S.V. Hizhnyak [i dr.]; patentoobladatel' Krasnoyarskiy GAU. № 2018137887. Zayavl. 26.10.2018, opubl. 12.11.2020, Byul. № 32.
13. Impact of the fermentation parameters pH and temperature on stress resilience of Lactobacillus reuteri DSM 17938 / A. Hernandez [et al.] // AMB Expr. 2019. Vol. 9. № 66. DOI: 10.1186/ s13568-019-0789-2.
14. Optimization of protective agents for the freeze-drying of Paenibacillus polymyxa Kp10 as a potential biofungicide / H.S. Nasran [et al.] // Molecules. 2020. № Vol. 25. № 11. DOI:https://doi.org/10.3390/molecules25112618.
15. Faybich M.M. Stabilizaciya vakcinnyh preparatov v processe vysushivaniya i hraneniya // Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunologii. 1968. № 2. S. 59–66.
16. Standartnaya operacionnaya procedura po liofilizacii kul'tur VKM s ispol'zovaniem raznyh rezhimov pervichnoy i vtorichnoy sushki / sost. S.M. Ozerskaya, E.O. Puchkov, N.E. Ivanushkina. Puschino, 2011.
17. Ohapkina V.Yu. Metody podderzhaniya mikrobnyh kul'tur. Ch. 2. Liofilizaciya // Teoreticheskaya i prikladnaya ekologiya. 2009. № 4. S. 21–32.
