Россия
Россия
с 01.01.2013 по настоящее время
Красноярск, Красноярский край, Россия
Красноярск, Красноярский край, Россия
Цель исследования – проверка возможности лиофилизации штаммов Alternaria tenuissima и Geomyces pannorum, выделенных авторами в качестве потенциальных продуцентов амилазы, для пищевой промышленности. Конидии изучаемых штаммов суспендировали в защитных средах и лиофилизировали с помощью лиофилизатора Bio-Rus-4SFD. Использовали три защитные среды: стандартный желатин-сахарозный агар (сахароза 10 %, желатин 1,5 %, агар 0,01 %), рекомендованный Всероссийской коллекцией микроорганизмов; желатин-сахарозный агар с добавлением 1 % аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта; пептон-сахарозо-глицериновая смесь, разработанная авторами (вода дистиллированная 90 мл, глицерин 10 мл, сахароза 10 г, пептон 3,2 г). Контролем служили конидии, суспендированные в дистиллированной воде без лиопротекторов. Жизнеспособность лиофилизированных конидий оценивали по их способности к прорастанию на агаризованной культуральной среде. Выживаемость конидий G. pannorum при лиофилизации во всех вариантах, за исключением контроля, была статистически значимо (p<0,001) выше, чем выживаемость конидий A. tenuissima. Жизнеспособность лиофилизированных конидий A. tenuissima не зависела от использования защитных сред и составила в контрольном варианте 75,9 %, в варианте с желатин-сахарозным агаром 76,4 %, в варианте с пептон-сахарозо-глицериновой смесью 77,1 %. Жизнеспособность лиофилизированных конидий G. pannorum без использования защитных сред составила 82,0 %, в варианте с желатин-сахарозным агаром 95,3 %, в варианте с пептон-сахарозо-глицериновой смесью 88,1 %. Добавление в защитную среду аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта привело к статистически значимому (p<0,001) снижению доли выживших при лиофилизации конидий A. tenuissima до 7,2 %, а доли выживших конидий G. pannorum до 44,4 %.
амилаза, Alternaria tenuissima, Geomyces pannorum, лиофилизация, защитные среды
Введение. Одними из наиболее востребованных ферментов микробного происхождения, применяемых в пищевой и перерабатывающей промышленности, а также в сельском хозяйстве, являются амилазы, на долю которых приходится около 25 % мирового рынка ферментов. Микробные амилазы применяют для конверсии крахмала в олигосахариды и в глюкозу в бродильных и крахмало-паточных производствах, для отбеливания сырья в бумажном и текстильном производствах, в качестве биодобавок к моющим средствам, а также в качестве добавок в крахмалсодержащие корма в птицеводстве и животноводстве для повышения их усвояемости [1–3].
Несмотря на обилие амилолитических штаммов, применяемых в промышленности, постоянно идет поиск новых, в т. ч. нетрадиционных продуцентов микробных амилаз. В качестве одного из перспективных продуцентов амилолитических ферментов рассматриваются грибы р. Alternaria [4–6]. Другим перспективным продуцентом, позволяющим осуществлять процесс при пониженной температуре, являются выделенные из пещер низкотемпературные амилолитические штаммы Geomyces pannorum [7, 8].
Использование штаммов в биотехнологических процессах невозможно без сохранения их исходных вариантов в микробиологических коллекциях. Общепризнанным, наиболее надежным способом такого сохранения считается их сублимационное высушивание из замороженного состояния (лиофилизация) [9, 10]. Главной проблемой при лиофилизации является возможная гибель микробных клеток в процессе замораживания и высушивания. Для решения этой проблемы используют разнообразные эмпирически подбираемые защитные среды, повышающие долю выживших при лиофилизации клеток [11].
Цель исследований – изучение возможности лиофилизации выделенных авторами в ходе предыдущих исследований амилолитических штаммов Alternaria tenuissima К22 и Geomyces pannorum ВКМ F-4777D.
Задачи: проверка возможности сохранения жизнеспособности штаммов при лиофилизации без использования защитных сред, с использованием стандартных защитных сред; выбор защитной среды, обеспечивающей максимальное сохранение жизнеспособности исследуемых штаммов при лиофилизации.
Объекты и методы. Объектами исследования служили выделенные авторами штаммы Alternaria tenuissima К22 и Geomyces pannorum ВКМ F-4777D. Штамм Alternaria tenuissima К22 выделен из инфицированного зерна яровой пшеницы, штамм G. pannorum ВКМ F-4777D выделен из грунта карстовой пещеры Караульная-2 и запатентован в качестве низкотемпературного продуцента амилазы [12]. Оба штамма характеризуются высокой амилолитической активностью (рис. 1).
Конидии изучаемых штаммов суспендировали в одной из защитных сред, после чего лиофилизировали в лиофильной сушилке Bio-Rus-4SFD в следующем режиме: замораживание при –36 °C в течение 5 ч; основная сушка при –40 °C в течение 15 ч при давлении 60 Па; вторичная сушка с шагом от 5 °C до 15 °C при давлении 80 Па в течение 5 ч [13, 14].
Рис. 1. Амилолитическая активность изучаемых штаммов: 1 – A. tenuissima К22; 2 – G. pannorum ВКМ F-4777D
В качестве защитных сред использовали сахарозо-желатиновый агар (среду Файбича) [15, 16], среду Файбича с 1 % аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта [17] и разработанную авторами пептон-сахарозо-глицериновую среду следующего состава: пептон ферментативный сухой – 3,2 г; сахароза – 10 г; глицерин – 10 мл; вода дистиллированная – 90 мл. Контролем служили конидии, суспендированные в дистиллированной воде без добавления лиопротекторов.
Жизнеспособность конидий после лиофилизации определяли прямым методом по их способности к прорастанию на агаризованной питательной среде (рис. 2).
Долю выживших конидий определяли как отношение числа конидий, сформировавших проростковые гифы, к общему числу конидий. Среднее число конидий, просмотренных в каждом варианте на предмет наличия проростковых гиф, составило 168 шт. для A. tenuissima К22 и 282 шт. для G. pannorum ВКМ F-4777D.
Рис. 2. Примеры непроросших (1) и проросших (2) конидий изучаемых штаммов: верхние
фотографии – A. tenuissima К22; нижние фотографии – G. pannorum ВКМ F-4777D
Статистическую значимость различий между контрольным вариантом и вариантами с защитными средами по доле проросших конидий проверяли точным тестом Фишера для таблиц 2 × 2 с использованием GraphPad QuickCalcs в качестве программного обеспечения.
Результаты и их обсуждение. Выживаемость конидий A. tenuissima К22 в контроле (без использования защитной среды) составила 75,9 %. Использование защитной среды Файбича и пептон-сахарозо-глицериновой среды не привело к статистически значимому изменению доли выживших конидий, которая составила 76,4 % для среды Файбича и 77,1 % для пептон-сахарозо-глицериновой среды. Введение аскорбиновой кислоты в среду Файбича привело к статистически значимому (p < 0,001) снижению доли выживших конидий до 7,2 % (рис. 3).
Выживаемость конидий G. pannorum ВКМ F-4777D в контроле (без использования защитной среды) составила 82,0 %. Использование защитной среды Файбича привело к статистически значимому (p < 0,001) увеличению доли выживших конидий до 95,3 %. Пептон-сахарозо-глицериновая среда также статистически значимо (p < 0,05) увеличила долю выживших конидий до 88,1 %. Как и в случае с A. tenuissima К22, введение аскорбиновой кислоты в среду Файбича привело к статистически значимому (p < 0,001) снижению доли выживших конидий G. pannorum ВКМ F-4777D (до 44,4 %) (рис. 4).
Рис. 3. Прорастание лиофилизированных конидий A. tenuissima К22
в разных вариантах эксперимента
Рис. 4. Прорастание лиофилизированных конидий G. pannorum ВКМ F-4777D
в разных вариантах эксперимента
В целом по эксперименту выживаемость конидий G. pannorum при лиофилизации во всех вариантах, за исключением контроля, была статистически значимо (p < 0,001) выше, чем выживаемость конидий A. tenuissima (табл.).
Различия между прорастанием конидий A. tenuissima К22 и G. pannorum ВКМ F-4777D
в разных вариантах эксперимента
|
Вариант защитной среды |
Различие |
Статистическая значимость различий |
||
|
раз |
процентных пунктов |
p двустороннее |
p одностороннее |
|
|
Контроль без лиопротекторов |
1,08 |
6,1 |
0,1320 |
0,0691 |
|
Среда Файбича |
1,25 |
18,9 |
< 0,0001 |
< 0,0001 |
|
Среда Файбича с аскорбиновой кислотой |
6,16 |
37,2 |
< 0,0001 |
< 0,0001 |
|
Пептон-сахарозо-глицериновая среда |
1,14 |
11,0 |
0,0005 |
0,0003 |
Таким образом, A. tenuissima К22 и G. Pannorum ВКМ F-4777D при лиофилизации продемонстрировали хорошую выживаемость конидий, которая даже без использования защитных сред сохраняется на уровне, вполне достаточном для практического использования лиофилизированных культур при хранении этих штаммов.
Заключение
- Оба изученных штамма демонстрируют высокую (75,9 % у A. tenuissima К22 и 82,0 % у G. pannorum ВКМ F-4777D) жизнеспособность конидий после лиофилизации без использования защитных сред.
- Защитные среды не оказывают статистически значимого влияния на выживаемость конидий A. tenuissima К22 и статистически значимо повышают выживаемость конидий G. Pannorum ВКМ F-4777D (в 1,16 раза при использовании среды Файбича и в 1,07 раза при использовании пептон-сахарозо-глицериновой среды).
- Введение в среду Файбича аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта ведет к значительному снижению доли выживших при лиофилизации конидий (в 10,61 раза у A. tenuissima К22 и в 2,15 раза у G. pannorum ВКМ F-4777D).
- На основе полученных результатов можно рекомендовать проведение лиофилизации конидий A. tenuissima К22 без использования защитных сред, а лиофилизацию конидий G. Pannorum ВКМ F-4777D – с использованием защитной среды Файбича либо без использования защитных сред.
1. De Souza P.M. Application of microbial α-amylase in industry – A review // Brazilian Journal of Microbiology. 2010. № 4. P. 850–861.
2. Effects of dietary amylase and sucrose on productivity of cows fed low-starch diets / C.F. Vargas-Rodriguez [et al.] // J. Dairy Sci. 2014. 97(7). P. 4464–4470.
3. Cowieson A.J., Vieira S.L., Stefanello C. Exogenous microbial amylase in the diets of poultry: what do we know? // J. Appl. Poult. Res. 2019. 28 (3). P. 556–565.
4. Shafique S., Bajwa R., Shafique S. Alpha-amylase production by toxigenic fungi // Natural Product Research. 2010. 24(15). P. 1449–1456.
5. Abd A.A., Mostafa, F. Production and Characterization of Fungal α-Amylase from Marine Alternata Utilizing Lignocellulosic Wastes and Its Application // Res. J. Pharm., Biol. Chem. Sci. 2015. 6. P. 813–825.
6. Production of Glucoamylase from Novel Strain of Alternaria Alternata under Solid State Fermentation / D.E. Nayab [et al.] // BioMed Research International. 2022. P. 9. DOI: 10.1155/ 2022/2943790.
7. Хижняк С.В., Пампуха В.Т. Микробные сообщества карстовых пещер как потенциальный источник продуцентов низкотемпературных амилаз // Вестник Омского государственного аграрного университета. 2016. № 1 (21). С. 104–110.
8. Влияние температуры на скорость роста амилолитических штаммов Geomyces pannorum / С.В. Хижняк [и др.] // Вестник КрасГАУ. 2018. № 1 (136). С. 214–221.
9. Adams J. The principles of freeze-drying // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 368. P. 15–38. DOI:https://doi.org/10.1007/978-1-59745-362-2_2.
10. Stacey J.N., Day J. Long-term ex-situ conservation of biological resources and the role of biological resource centers // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 368. P. 1–14. DOI: 10.1007/ 978-1-59745-362-2_1.
11. Грачева И.В., Осин А.В. Механизмы повреждений бактерий при лиофилизации и протективное действие защитных сред // Проблемы особо опасных инфекций. 2016. № 3. С. 5–12. DOI:https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-3-5-12.
12. Пат. RU 2736223 C1. Психротолерантный штамм мицелиального гриба Geomyces pannorum ВКМ F-4777D – продуцент α-амилазы / С.В. Хижняк [и др.]; патентообладатель Красноярский ГАУ. № 2018137887. Заявл. 26.10.2018, опубл. 12.11.2020, Бюл. № 32.
13. Impact of the fermentation parameters pH and temperature on stress resilience of Lactobacillus reuteri DSM 17938 / A. Hernandez [et al.] // AMB Expr. 2019. Vol. 9. № 66. DOI: 10.1186/ s13568-019-0789-2.
14. Optimization of protective agents for the freeze-drying of Paenibacillus polymyxa Kp10 as a potential biofungicide / H.S. Nasran [et al.] // Molecules. 2020. № Vol. 25. № 11. DOI:https://doi.org/10.3390/molecules25112618.
15. Файбич М.М. Стабилизация вакцинных препаратов в процессе высушивания и хранения // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1968. № 2. С. 59–66.
16. Стандартная операционная процедура по лиофилизации культур ВКМ с использованием разных режимов первичной и вторичной сушки / сост. С.М. Озерская, Е.О. Пучков, Н.Е. Иванушкина. Пущино, 2011.
17. Охапкина В.Ю. Методы поддержания микробных культур. Ч. 2. Лиофилизация // Теоретическая и прикладная экология. 2009. № 4. С. 21–32.
