Moscow, Russian Federation
Moscow, Russian Federation
Moscow, Russian Federation
Moscow, Moscow, Russian Federation
The aim of the study is to use modern microbiological approaches to obtain a new strain of baker's yeast. The objects of the study were strains of baker's yeast from the Laboratory of Baker's Yeast Biotechnology of the Institute of Food Biotechnology. Selection and screening of the yeast strain were carried out by clonal plating of the original strain cells on agar media with glucose-asparagine medium (8 % DM) and with malt wort (12 and 18 % DM). The content of crude protein in the yeast biomass was determined by the Kjeldahl method on an automatic BEGER unit (Slovenia). Biomass accumulation was determined by the gravimetric method after cultivation, separating the solid and liquid fractions by centrifugation. Maltase, zymase and proteolytic activities were determined according to known methods. Ergosterol content – spectrophotometric method based on extraction with ethanol and sulfuric acid with triterpene compounds, at a wavelength of λ = 328 nm. The biomass (solid fraction) was separated from the filtrate by centrifugation in a laboratory centrifuge OPM-16 for 15 min at a rotor speed of 6000 rpm. Comparative studies were conducted to select the most productive strain of baker's yeast in terms of biochemical parameters. Comparative characteristics of yeast strains allowed us to select the most promising one – Saccharomyces cerevisiae Y-581, characterized by the ability to a higher level of protein synthesis, maltase, zymase activities, as well as ergosterol and osmosensitivity indicators. A two-stage selection and screening for the above indicators were carried out with the selected strain. As a result of microbiological approaches relative to the original strain S. cerevisiae Y-581, a population of Saccharomyces cerevisiae 581-GA-21c was isolated, characterized by a higher biosynthetic capacity not only in relation to ergosterol and protein, but also to the synthesis of enzymes, especially proteolytic ones. The isolated strain had a higher permeability of the cell membrane, as evidenced by its osmosensitivity indicators. The new strain also had distinctive features in morphological characteristics. This strain will be used in the field of obtaining enriched ingre¬dients for the development of new types of food products.
baker's yeast, new types of products, selection, microbiological approaches, baker's yeast strain, enrichment of food ingredients
Введение. В современном динамическом развитии общества вопрос получения и внедрения новых видов обогащенных пищевых продуктов требует безотлагательного решения представителей научных, технических и технологических представителей сообществ. Основой решения данного вопроса являются научные исследования и полученные на их основе разработки, в результате которых будут получены новые знания в виде новых экспериментальных данных, а также разработаны новые подходы, методы и способы для формирования базы новых технологий [1–3].
Новая структура питания человека подразумевает ряд обстоятельств, с изменением которых необходимо корректировать методологию обогащения пищевых продуктов. Эти условия связаны с пищевой ценностью продуктов, их усвояемостью, изменениями экологии и климата, питанием в регионах, а также пополнением рынка новыми продуктами с различными функциональными особенностями [4–6].
Программы профилактики микронутриентной недостаточности были сформулированы в начале 80-х гг. ХХ в. В основе Государственной политики здорового питания проводится мониторинг данных эпидемиологического состояния, пищевых предпочтений населения, а также профилактических мероприятий [7].
Целенаправленное обогащение культуральной среды микроэлементами позволит повысить уровень органической формы металла в дрожжевой биомассе за счет аккумулирования неорганических солей в процессе выращивания. Уровень обогащения хлеба при использовании фортифицированных микроэлементами дрожжей позволит обеспечить не менее 15 % от суточной потребности в эссенциальных микроэлементах. При использовании в рецептуре обогащенных дрожжей их количество значительно меньше, чем при использовании в рецептуре приготовления обогащенного хлеба [8–10].
Современные микробиологические методы, включая многоступенчатую селекцию и скрининг микроорганизмов, – один из важнейших путей получения перспективных штаммов для использования в технологиях получения пищевых ингредиентов.
Цель исследования – использование современных микробиологических подходов для получения нового штамма хлебопекарных дрожжей.
Объекты и методы. В качестве объектов для исследования были выбраны штаммы хлебопекарных дрожжей лаборатории биотехнологии пекарных дрожжей Института пищевой биотехнологии. Селекцию и скрининг штамма дрожжей осуществляли путем клонального рассева клеток исходного штамма на агаризованные среды с глюкозо-аспарагиновой средой (8 % СВ) и солодовым суслом (12 и 18 % СВ).
Содержание сырого протеина в дрожжевой биомассе определяли методом Кьельдаля на автоматической установке BEGER (Словения) [11]. Накопление биомассы определяли весовым методом после культивирования, разделяя центрифугированием твердую и жидкую фракции [12]. Мальтазную, зимазную и протеолитическую активности определяли согласно известным методикам [13]. Содержание эргостерина – спектрофотометрическим методом, основанном на экстракции этанолом и серной кислотой с тритерпеновыми соединениями при длине волны λ = 328 нм [14].
Биомассу (твердая фракция) отделяли от фильтрата центрифугированием на лабораторной центрифуге ОПМ-16 в течение 15 мин при скорости вращения ротора 6 000 об/мин.
Для статистической обработки экспериментальных данных, полученных не менее, чем в 3 повторностях, использовали метод однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки при р < 0,05 и программы Statistica 6.0.
Результаты и их обсуждение. На первом этапе проводили сравнительные исследования количественных и качественных характеристик хлебопекарных дрожжей S. cerevisiae с целью установления перспективного для обогащения штамма.
В результате сравнительной характеристики штаммов Saccharomyces cerevisiae был выбран Y-581, характеризующийся способностью к более высокому уровню синтеза белка, мальтазной, зимазной активностей, а также показателей эргостерина и осмочувствительности (табл. 1).
Таблица 1
Сравнительная оценка штаммов хлебопекарных дрожжей по биохимическим показателям
|
Номер штамма Saccharomyces сerevisiae |
Сырой протеин, % на а.с.в. |
Осмочувствительность, мин |
Мальтазная активность, мин |
Зимазная активность, мин |
Эргостерин, % на а.с.в. |
Накопление биомассы, % |
|
Y-576 |
41,0± 2,0 |
18±0,8 |
76±3,8 |
69±3,4 |
7,6±0,3 |
5,8±0,3 |
|
Y-501 |
42,4±2,1 |
13±0,5 |
80±3,9 |
48±2,8 |
9,8±0,5 |
5,5±0,2 |
|
Y-53 |
42,5±2,2 |
16±0,6 |
85±4,2 |
52±2,5 |
5,5±0,2 |
5,2±0,2 |
|
Y-1218 |
42,0±2,0 |
19±0,8 |
68±3,0 |
63±3,3 |
5,2±0,2 |
4,7±0,2 |
|
Y-581 |
42,6±2,2 |
12±0,4 |
89±4,8 |
45±2,2 |
10,8±0,6 |
5,9±0,3 |
|
Y-3439 |
41,8±2,2 |
20±0,5 |
65±3,2 |
58±2,8 |
6,2±0,3 |
4,3±0,2 |
|
Y-59 |
40,4±2,0 |
20±0,5 |
64±3,0 |
70±3,3 |
4,7±0,2 |
4,0±0,1 |
|
Y-722 |
41,2±2,1 |
22±0,5 |
72±3,6 |
72±3,5 |
4,3±0,2 |
4,8±0,2 |
Здесь и далее: данные представлены в виде средних ± стандартное отклонение.
На следующем этапе работы была проведена многоступенчатая селекция и скрининг отобранного штамма S. cerevisiae Y-581 для выделения более активного варианта, перспективного к обогащению железом и медью. Основными биохимическими признаками для фортификации дрожжей являются содержание белка и осмочувствительность (проницаемость клеточной стенки дрожжей).
Первым этапом селекционных работ являлся отбор активных вариантов по содержанию белка и осмочувствительности. При клональном рассеве клеток стабильного исходного дрожжевого штамма Y-581 на агаризованную среду наблюдали рост однотипных по цвету и морфологии колоний, различающихся размером. В результате рассева данного штамма на глюкозо-аспарагиновую среду с концентрацией СВ 8,0 % были выделены 12 активных колоний на 144 ч выращивания при температуре 30 °С, показатели которых представлены в таблице 2.
Таблица 2
Сравнительная характеристика активных вариантов Saccharomyces cerevisiae Y-581
|
Вариант |
Сырой протеин, % на а.с.в. |
Осмочувствительность, мин |
|
581-ГА-7 |
42,0±2,1 |
14,0±0,7 |
|
581-ГА-12 |
45,2±2,2 |
18,5±0,9 |
|
581-ГА-14 |
38,2±1,9 |
17,5±0,8 |
|
581-ГА -18 |
41,5±2,0 |
20,5±1,0 |
|
581-ГА-21 |
46,2±2,3 |
10,5±0,5 |
|
581-ГА-29 |
35,0±1,7 |
17,5±0,8 |
|
581-ГА-35 |
37,8±1,8 |
13,5±0,6 |
|
581-ГА-37 |
36,9±1,8 |
18,0±0,9 |
|
581-ГА-41 |
41,2±2,0 |
15,5±0,7 |
|
581-ГА-45 |
45,3±2,2 |
13,5±0,6 |
|
581-ГА-52 |
42,2±2,1 |
14,5±0,7 |
|
581-ГА-61 |
39,5±1,8 |
11,9±0,5 |
|
Исх. 581 |
42,3±2,1 |
12,5±0,6 |
В результате проведенных селекционных исследований отобрана наиболее активная популяция Saccharomyces cerevisiae 581-ГА-21, обладающая способностью к повышенному синтезу белка (46,2 %) и более низким уровнем осмочувствительности (10,5 мин) по сравнению с контрольным вариантом (табл. 2).
На втором этапе селекции было исследовано влияние различных концентраций агаризованных сред, используемых для рассева выделенного варианта S. cerevisiae 581-ГА-21, на изменения его биосинтетических свойств. Для отбора колоний использовали агаризованные среды с концентрацией солодового сусла с 12 и 18 % СВ. Отобранные клоны тестировали по уровню синтеза белка и осмочувствительности (табл. 3).
Таблица 3
Сравнительная характеристика активных вариантов дрожжей
Saccharomyces cerevisiae 581-ГА-21
|
Вариант |
12 % СВ |
18 % СВ |
Вариант |
||
|
Сырой протеин, % на а.с.в. |
Осмочувствительность, мин |
Сырой протеин, % на а.с.в. |
Осмочувствительность, мин |
||
|
581-ГА-3с |
43,2±2,1 |
15,5±0,7 |
42,0±2,1 |
14,0±0,7 |
581-ГА-5с |
|
581-ГА-11с |
47,0±2,3 |
13,5±0,6 |
46,2±2,3 |
11,5±0,5 |
581-ГА-13с |
|
581-ГА-14с |
39,2±1,9 |
14,5±0,7 |
39,9±1,9 |
11,9±0,5 |
581-ГА-17с |
|
581-ГА-17с |
41,7±2,0 |
19,5±0,9 |
42,5±2,1 |
10,8±0,5 |
581-ГА-19с |
|
581-ГА-23с |
52,1±2,6 |
7,0±0,3 |
53,6±2,6 |
5,5±0,2 |
581-ГА-21с |
|
581-ГА-29с |
42,3±2,1 |
17,5±0,8 |
35,0±1,8 |
14,5±0,7 |
581-ГА-27с |
|
581-ГА-33с |
39,0±1,9 |
18,5±0,8 |
37,8±1,9 |
13,5±0,6 |
581-ГА-30с |
|
581-ГА-40с |
39,9±1,9 |
12,5±0,6 |
36,9±1,9 |
12,3±0,6 |
581-ГА-32с |
|
581-ГА-44с |
41,8±2,0 |
14,5±0,7 |
44,2±2,2 |
15,1±0,7 |
581-ГА-42с |
|
581-ГА-48с |
42,6±2,1 |
17,1±0,8 |
45,3±2,5 |
9,5±0,4 |
581-ГА-47с |
|
581-ГА-51с |
46,5 ±2,3 |
12,5±0,6 |
43,2±2,3 |
6,9±0,3 |
581-ГА-50с |
|
581-ГА-57с |
43,2±2,1 |
19,0±0,9 |
39,5±1,9 |
0,9±0,4 |
581-ГА-56с |
|
Исх. 581 |
44,2±2,2 |
10,7±0,5 |
44,8±2,2 |
10,0±0,5 |
Исх. 581 |
При культивировании дрожжей в глубинных условиях на стандартной питательной среде при температуре 30 °С в течение 48 ч установлено, что более высокой биосинтетической способностью по отношению к белку обладали 3 популяции, выделенные при рассеве на средах с концентрацией РСВ 12 %, и 2 клона Y – 18 %, из которых клон Saccharomyces cerevisiae 581-ГА-21с (выделенный со среды с 18 % СВ) проявил наилучшие показатели по содержанию белка и осмочувствительности (см. табл. 3). В этом варианте содержание белка составило 53,6 % и осмочувствительность – 5,5 мин, что превысило показатели исходного штамма по белку на 19,6 %, а осмочувствительность снизилась в 1,8 раза.
Результаты сравнительных исследований биосинтетической способности выделенного и исходного штамма показали, что уровень синтеза эргостерина увеличился несущественно, но по содержанию белка клон S. cerevisiae Y-581-ГА-21с превосходил показатели исходного штамма. При этом осмочувствительность снизилась на 45 %; отмечено также некоторое повышение его зимазной (на 38,9 %) и протеолитической (на 42,3 %) активностей по сравнению с показателями, полученными при тестировании исходного штамма дрожжей (рис. 1, а, б).
Таким образом, в результате многоступенчатой селекции исходного штамма S. cerevisiae
Y-581 была выделена популяция Saccharomyces cerevisiae 581-ГА-21с, несколько отличающаяся по морфологическим признакам (рис. 2) и с более высокой биосинтетической способностью не только по отношению к эргостерину и белку, но и к синтезу ферментов, особенно протеолитических. Кроме того, выделенный штамм обладал более высокой проницаемостью клеточной мембраны, о чем свидетельствовали показатели его осмочувствительности.
а
б
Рис. 1. Биохимические показатели исходного и селекционированного штамма S. cerevisiae Y-581с
S. cerevisiae Y-581 S. cerevisiae Y-581-ГА-21с (Y-581с)
Рис. 2. Штаммы дрожжей S. cerevisiae Y-581 и S. cerevisiae Y-581-ГА-21с
Заключение. Селекционированный штамм S. cerevisiae Y-581с был выбран в качестве перспективного объекта по основным признакам, необходимым для фортификации микроэлементами (высокое содержание белка и эргостерина, низкая осмочувствительность и повышенная протеолитическая активность).
На основании современных микробиологических подходов получен новый штамм хлебопекарных дрожжей S. cerevisiae Y-581-с, который будет использован в дальнейших исследованиях по созданию ингредиентов различного состава.
1. Mayurnikova L.A., Novoselov S.V., Bolhovitina E.N. Formirovanie potrebitel'skih predpochteniy k novacionnym produktam pitaniya v regional'nyh usloviyah // Polzunovskiy vestnik. 2010. № 4–2. S. 13–19.
2. Kornen N.N., Viktorova E.P., Evdokimova O.V. Metodologicheskie podhody k sozdaniyu produktov zdorovogo pitaniya // Vop¬rosy pitaniya. 2015. T. 84, № 1. S. 95–99.
3. Tret'yak L.N., Yavkina D.I. Dopolnitel'nye trebovaniya k kachestvu i bezopasnosti pischevyh produktov, obogaschennyh dobavkami // Pischevaya promyshlennost'. 2018. № 5. S. 18–21.
4. Kodencova V.M. Obosnovanie urovnya obogascheniya pischevyh produktov vitaminami i mineral'nymi veschestvami // Voprosy pitaniya. 2010. T. 79, № 1. S. 23–33.
5. Obespechennost' naseleniya Rossii mikronutrientami i vozmozhnosti ee korrekcii. Sostoyanie problemy / V.M. Kodencova [i dr.] // Voprosy pitaniya. 2017. T. 86 (4). S. 113‒124.
6. Kodencova V.M., Risnik D.V., Bessonov V.V. Soedineniya zheleza dlya obogascheniya pischevyh produktov: sravnitel'nyy analiz effektivnosti // Mikroelementy v medicine. 2023. T. 24 (1). S. 10–19.
7. Biotehnologicheskie aspekty polucheniya funkcional'nyh ingredientov na osnove konversii biomassy Saccharomyces cerevi-siae 985-T / E.M. Serba [i dr.] // Biotehnologiya. 2020. T. 36, № 4. S. 34–41. DOI:https://doi.org/10.21519/0234-2758-2020-36-4-34-41.
8. Perspektivnye rasy hlebopekarnyh drozhzhey dlya polucheniya pischevyh ingredientov, obogaschennyh selenom i hromom / E.M. Serba [i dr.] // Voprosy pitaniya. 2020. T. 89, № 6. S. 48–57.
9. Drozdov V.N. Racional'noe vozmeschenie deficita vitaminov i mikroelementov // Lechebnoe delo. 2009. № 3. S. 34–40.
10. Nutriom kak napravlenie «glavnogo udara»: opredelenie fiziologicheskih pot-rebnostey v makro- i mikronutrientah, minornyh biologicheski aktivnyh veschestvah pischi / V.A. Tutel'yan [i dr.] //Voprosy pitaniya. 2020. T. 89, № 4. S. 24–34.
11. GOST 13496.4-2019. Korma. Kombikorma. Kombikormovoe syr'e. Metod opredeleniya soderzhaniya azota i syrogo proteina. M., 2019.
12. Kul'tivirovanie mikroorganizmov kak osnova biotehnologicheskogo processa / S.E. Aleshina [i dr.]. Orenburg, 2017.
13. Chernova A.P., Batzhargal H. Metod ocenki fermentativnoy aktivnosti hlebopekarnyh drozhzhey // Pischevaya promyshlennost'. 2019. № 8. S. 84–88.
14. Ispol'zovanie ekstraktov yablochnogo zhmyha dlya intensifikacii biosinteza ergosterina / I.V. Kalinina [i dr.] // Vestnik Yuzhno-Ural'skogo gosudarstvennogo universiteta. Ser. «Pischevye i biotehnologii». 2021. T. 9, № 2. S. 75–82.
