Москва, Россия
Москва, Россия
Москва, Россия
Москва, г. Москва и Московская область, Россия
Цель исследования – использование современных микробиологических подходов для получения нового штамма хлебопекарных дрожжей. Объекты исследования – штаммы хлебопекарных дрожжей лаборатории биотехнологии пекарных дрожжей Института пищевой биотехнологии. Селекцию и скрининг штамма дрожжей осуществляли путем клонального рассева клеток исходного штамма на агаризованные среды с глюкозо-аспарагиновой средой (8 % СВ) и солодовым суслом (12 и 18 % СВ). Содержание сырого протеина в дрожжевой биомассе определяли методом Кьельдаля на автоматической установке BEGER (Словения). Накопление биомассы определяли весовым методом после культивирования, разделяя центрифугированием твердую и жидкую фракции. Мальтазную, зимазную и протеолитическую активности определяли согласно известным методикам. Содержание эргостерина – спектрофотометрическим методом, основанным на экстракции этанолом и серной кислотой с тритерпеновыми соединениями, при длине волны λ = 328 нм. Биомассу (твердая фракция) отделяли от фильтрата центрифугированием на лабораторной центрифуге ОПМ-16 в течение 15 мин при скорости вращения ротора 6000 об/мин. Проведены сравнительные исследования для выбора наиболее продуктивного в отношении биохимических показателей штамма хлебопекарных дрожжей. Сравнительная характеристика штаммов дрожжей позволила отобрать наиболее перспективный – Saccharomyces cerevisiae Y-581, характеризующийся способностью к более высокому уровню синтеза белка, мальтазной, зимазной активностей, а также показателей эргостерина и осмочувствительнос¬ти. С отобранным штаммом были проведена двухступенчатая селекция и скрининг по вышеу¬казанным показателям. В результате микробиологических подходов относительно исходного штамма S. cerevisiae Y-581 была выделена популяция Saccharomyces cerevisiae 581-ГА-21с, отличающаяся более высокой биосинтетической способностью не только по отношению к эргостерину и белку, но и к синтезу ферментов, особенно протеолитических. Выделенный штамм обладал более высокой проницаемостью клеточной мембраны, о чем свидетельствовали показатели его осмочувствительности. Также новый штамм имел отличительные особенности и по морфологическим признакам. Данный штамм будет использован в области получения обогащенных ингредиентов для разработок новых видов пищевой продукции.
хлебопекарные дрожжи, новые виды продукции, селекция, микробиологичес¬кие подходы, штамм хлебопекарных дрожжей, обогащение пищевых ингредиентов
Введение. В современном динамическом развитии общества вопрос получения и внедрения новых видов обогащенных пищевых продуктов требует безотлагательного решения представителей научных, технических и технологических представителей сообществ. Основой решения данного вопроса являются научные исследования и полученные на их основе разработки, в результате которых будут получены новые знания в виде новых экспериментальных данных, а также разработаны новые подходы, методы и способы для формирования базы новых технологий [1–3].
Новая структура питания человека подразумевает ряд обстоятельств, с изменением которых необходимо корректировать методологию обогащения пищевых продуктов. Эти условия связаны с пищевой ценностью продуктов, их усвояемостью, изменениями экологии и климата, питанием в регионах, а также пополнением рынка новыми продуктами с различными функциональными особенностями [4–6].
Программы профилактики микронутриентной недостаточности были сформулированы в начале 80-х гг. ХХ в. В основе Государственной политики здорового питания проводится мониторинг данных эпидемиологического состояния, пищевых предпочтений населения, а также профилактических мероприятий [7].
Целенаправленное обогащение культуральной среды микроэлементами позволит повысить уровень органической формы металла в дрожжевой биомассе за счет аккумулирования неорганических солей в процессе выращивания. Уровень обогащения хлеба при использовании фортифицированных микроэлементами дрожжей позволит обеспечить не менее 15 % от суточной потребности в эссенциальных микроэлементах. При использовании в рецептуре обогащенных дрожжей их количество значительно меньше, чем при использовании в рецептуре приготовления обогащенного хлеба [8–10].
Современные микробиологические методы, включая многоступенчатую селекцию и скрининг микроорганизмов, – один из важнейших путей получения перспективных штаммов для использования в технологиях получения пищевых ингредиентов.
Цель исследования – использование современных микробиологических подходов для получения нового штамма хлебопекарных дрожжей.
Объекты и методы. В качестве объектов для исследования были выбраны штаммы хлебопекарных дрожжей лаборатории биотехнологии пекарных дрожжей Института пищевой биотехнологии. Селекцию и скрининг штамма дрожжей осуществляли путем клонального рассева клеток исходного штамма на агаризованные среды с глюкозо-аспарагиновой средой (8 % СВ) и солодовым суслом (12 и 18 % СВ).
Содержание сырого протеина в дрожжевой биомассе определяли методом Кьельдаля на автоматической установке BEGER (Словения) [11]. Накопление биомассы определяли весовым методом после культивирования, разделяя центрифугированием твердую и жидкую фракции [12]. Мальтазную, зимазную и протеолитическую активности определяли согласно известным методикам [13]. Содержание эргостерина – спектрофотометрическим методом, основанном на экстракции этанолом и серной кислотой с тритерпеновыми соединениями при длине волны λ = 328 нм [14].
Биомассу (твердая фракция) отделяли от фильтрата центрифугированием на лабораторной центрифуге ОПМ-16 в течение 15 мин при скорости вращения ротора 6 000 об/мин.
Для статистической обработки экспериментальных данных, полученных не менее, чем в 3 повторностях, использовали метод однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки при р < 0,05 и программы Statistica 6.0.
Результаты и их обсуждение. На первом этапе проводили сравнительные исследования количественных и качественных характеристик хлебопекарных дрожжей S. cerevisiae с целью установления перспективного для обогащения штамма.
В результате сравнительной характеристики штаммов Saccharomyces cerevisiae был выбран Y-581, характеризующийся способностью к более высокому уровню синтеза белка, мальтазной, зимазной активностей, а также показателей эргостерина и осмочувствительности (табл. 1).
Таблица 1
Сравнительная оценка штаммов хлебопекарных дрожжей по биохимическим показателям
|
Номер штамма Saccharomyces сerevisiae |
Сырой протеин, % на а.с.в. |
Осмочувствительность, мин |
Мальтазная активность, мин |
Зимазная активность, мин |
Эргостерин, % на а.с.в. |
Накопление биомассы, % |
|
Y-576 |
41,0± 2,0 |
18±0,8 |
76±3,8 |
69±3,4 |
7,6±0,3 |
5,8±0,3 |
|
Y-501 |
42,4±2,1 |
13±0,5 |
80±3,9 |
48±2,8 |
9,8±0,5 |
5,5±0,2 |
|
Y-53 |
42,5±2,2 |
16±0,6 |
85±4,2 |
52±2,5 |
5,5±0,2 |
5,2±0,2 |
|
Y-1218 |
42,0±2,0 |
19±0,8 |
68±3,0 |
63±3,3 |
5,2±0,2 |
4,7±0,2 |
|
Y-581 |
42,6±2,2 |
12±0,4 |
89±4,8 |
45±2,2 |
10,8±0,6 |
5,9±0,3 |
|
Y-3439 |
41,8±2,2 |
20±0,5 |
65±3,2 |
58±2,8 |
6,2±0,3 |
4,3±0,2 |
|
Y-59 |
40,4±2,0 |
20±0,5 |
64±3,0 |
70±3,3 |
4,7±0,2 |
4,0±0,1 |
|
Y-722 |
41,2±2,1 |
22±0,5 |
72±3,6 |
72±3,5 |
4,3±0,2 |
4,8±0,2 |
Здесь и далее: данные представлены в виде средних ± стандартное отклонение.
На следующем этапе работы была проведена многоступенчатая селекция и скрининг отобранного штамма S. cerevisiae Y-581 для выделения более активного варианта, перспективного к обогащению железом и медью. Основными биохимическими признаками для фортификации дрожжей являются содержание белка и осмочувствительность (проницаемость клеточной стенки дрожжей).
Первым этапом селекционных работ являлся отбор активных вариантов по содержанию белка и осмочувствительности. При клональном рассеве клеток стабильного исходного дрожжевого штамма Y-581 на агаризованную среду наблюдали рост однотипных по цвету и морфологии колоний, различающихся размером. В результате рассева данного штамма на глюкозо-аспарагиновую среду с концентрацией СВ 8,0 % были выделены 12 активных колоний на 144 ч выращивания при температуре 30 °С, показатели которых представлены в таблице 2.
Таблица 2
Сравнительная характеристика активных вариантов Saccharomyces cerevisiae Y-581
|
Вариант |
Сырой протеин, % на а.с.в. |
Осмочувствительность, мин |
|
581-ГА-7 |
42,0±2,1 |
14,0±0,7 |
|
581-ГА-12 |
45,2±2,2 |
18,5±0,9 |
|
581-ГА-14 |
38,2±1,9 |
17,5±0,8 |
|
581-ГА -18 |
41,5±2,0 |
20,5±1,0 |
|
581-ГА-21 |
46,2±2,3 |
10,5±0,5 |
|
581-ГА-29 |
35,0±1,7 |
17,5±0,8 |
|
581-ГА-35 |
37,8±1,8 |
13,5±0,6 |
|
581-ГА-37 |
36,9±1,8 |
18,0±0,9 |
|
581-ГА-41 |
41,2±2,0 |
15,5±0,7 |
|
581-ГА-45 |
45,3±2,2 |
13,5±0,6 |
|
581-ГА-52 |
42,2±2,1 |
14,5±0,7 |
|
581-ГА-61 |
39,5±1,8 |
11,9±0,5 |
|
Исх. 581 |
42,3±2,1 |
12,5±0,6 |
В результате проведенных селекционных исследований отобрана наиболее активная популяция Saccharomyces cerevisiae 581-ГА-21, обладающая способностью к повышенному синтезу белка (46,2 %) и более низким уровнем осмочувствительности (10,5 мин) по сравнению с контрольным вариантом (табл. 2).
На втором этапе селекции было исследовано влияние различных концентраций агаризованных сред, используемых для рассева выделенного варианта S. cerevisiae 581-ГА-21, на изменения его биосинтетических свойств. Для отбора колоний использовали агаризованные среды с концентрацией солодового сусла с 12 и 18 % СВ. Отобранные клоны тестировали по уровню синтеза белка и осмочувствительности (табл. 3).
Таблица 3
Сравнительная характеристика активных вариантов дрожжей
Saccharomyces cerevisiae 581-ГА-21
|
Вариант |
12 % СВ |
18 % СВ |
Вариант |
||
|
Сырой протеин, % на а.с.в. |
Осмочувствительность, мин |
Сырой протеин, % на а.с.в. |
Осмочувствительность, мин |
||
|
581-ГА-3с |
43,2±2,1 |
15,5±0,7 |
42,0±2,1 |
14,0±0,7 |
581-ГА-5с |
|
581-ГА-11с |
47,0±2,3 |
13,5±0,6 |
46,2±2,3 |
11,5±0,5 |
581-ГА-13с |
|
581-ГА-14с |
39,2±1,9 |
14,5±0,7 |
39,9±1,9 |
11,9±0,5 |
581-ГА-17с |
|
581-ГА-17с |
41,7±2,0 |
19,5±0,9 |
42,5±2,1 |
10,8±0,5 |
581-ГА-19с |
|
581-ГА-23с |
52,1±2,6 |
7,0±0,3 |
53,6±2,6 |
5,5±0,2 |
581-ГА-21с |
|
581-ГА-29с |
42,3±2,1 |
17,5±0,8 |
35,0±1,8 |
14,5±0,7 |
581-ГА-27с |
|
581-ГА-33с |
39,0±1,9 |
18,5±0,8 |
37,8±1,9 |
13,5±0,6 |
581-ГА-30с |
|
581-ГА-40с |
39,9±1,9 |
12,5±0,6 |
36,9±1,9 |
12,3±0,6 |
581-ГА-32с |
|
581-ГА-44с |
41,8±2,0 |
14,5±0,7 |
44,2±2,2 |
15,1±0,7 |
581-ГА-42с |
|
581-ГА-48с |
42,6±2,1 |
17,1±0,8 |
45,3±2,5 |
9,5±0,4 |
581-ГА-47с |
|
581-ГА-51с |
46,5 ±2,3 |
12,5±0,6 |
43,2±2,3 |
6,9±0,3 |
581-ГА-50с |
|
581-ГА-57с |
43,2±2,1 |
19,0±0,9 |
39,5±1,9 |
0,9±0,4 |
581-ГА-56с |
|
Исх. 581 |
44,2±2,2 |
10,7±0,5 |
44,8±2,2 |
10,0±0,5 |
Исх. 581 |
При культивировании дрожжей в глубинных условиях на стандартной питательной среде при температуре 30 °С в течение 48 ч установлено, что более высокой биосинтетической способностью по отношению к белку обладали 3 популяции, выделенные при рассеве на средах с концентрацией РСВ 12 %, и 2 клона Y – 18 %, из которых клон Saccharomyces cerevisiae 581-ГА-21с (выделенный со среды с 18 % СВ) проявил наилучшие показатели по содержанию белка и осмочувствительности (см. табл. 3). В этом варианте содержание белка составило 53,6 % и осмочувствительность – 5,5 мин, что превысило показатели исходного штамма по белку на 19,6 %, а осмочувствительность снизилась в 1,8 раза.
Результаты сравнительных исследований биосинтетической способности выделенного и исходного штамма показали, что уровень синтеза эргостерина увеличился несущественно, но по содержанию белка клон S. cerevisiae Y-581-ГА-21с превосходил показатели исходного штамма. При этом осмочувствительность снизилась на 45 %; отмечено также некоторое повышение его зимазной (на 38,9 %) и протеолитической (на 42,3 %) активностей по сравнению с показателями, полученными при тестировании исходного штамма дрожжей (рис. 1, а, б).
Таким образом, в результате многоступенчатой селекции исходного штамма S. cerevisiae
Y-581 была выделена популяция Saccharomyces cerevisiae 581-ГА-21с, несколько отличающаяся по морфологическим признакам (рис. 2) и с более высокой биосинтетической способностью не только по отношению к эргостерину и белку, но и к синтезу ферментов, особенно протеолитических. Кроме того, выделенный штамм обладал более высокой проницаемостью клеточной мембраны, о чем свидетельствовали показатели его осмочувствительности.
а
б
Рис. 1. Биохимические показатели исходного и селекционированного штамма S. cerevisiae Y-581с
S. cerevisiae Y-581 S. cerevisiae Y-581-ГА-21с (Y-581с)
Рис. 2. Штаммы дрожжей S. cerevisiae Y-581 и S. cerevisiae Y-581-ГА-21с
Заключение. Селекционированный штамм S. cerevisiae Y-581с был выбран в качестве перспективного объекта по основным признакам, необходимым для фортификации микроэлементами (высокое содержание белка и эргостерина, низкая осмочувствительность и повышенная протеолитическая активность).
На основании современных микробиологических подходов получен новый штамм хлебопекарных дрожжей S. cerevisiae Y-581-с, который будет использован в дальнейших исследованиях по созданию ингредиентов различного состава.
1. Маюрникова Л.А., Новоселов С.В., Болховитина Е.Н. Формирование потребительских предпочтений к новационным продуктам питания в региональных условиях // Ползуновский вестник. 2010. № 4–2. С. 13–19.
2. Корнен Н.Н., Викторова Е.П., Евдокимова О.В. Методологические подходы к созданию продуктов здорового питания // Воп¬росы питания. 2015. Т. 84, № 1. С. 95–99.
3. Третьяк Л.Н., Явкина Д.И. Дополнительные требования к качеству и безопасности пищевых продуктов, обогащенных добавками // Пищевая промышленность. 2018. № 5. С. 18–21.
4. Коденцова В.М. Обоснование уровня обогащения пищевых продуктов витаминами и минеральными веществами // Вопросы питания. 2010. Т. 79, № 1. С. 23–33.
5. Обеспеченность населения России микронутриентами и возможности ее коррекции. Состояние проблемы / В.М. Коденцова [и др.] // Вопросы питания. 2017. Т. 86 (4). С. 113‒124.
6. Коденцова В.М., Рисник Д.В., Бессонов В.В. Соединения железа для обогащения пищевых продуктов: сравнительный анализ эффективности // Микроэлементы в медицине. 2023. Т. 24 (1). С. 10–19.
7. Биотехнологические аспекты получения функциональных ингредиентов на основе конверсии биомассы Saccharomyces cerevi-siaе 985-Т / Е.М. Серба [и др.] // Биотехнология. 2020. Т. 36, № 4. С. 34–41. DOI:https://doi.org/10.21519/0234-2758-2020-36-4-34-41.
8. Перспективные расы хлебопекарных дрожжей для получения пищевых ингредиентов, обогащенных селеном и хромом / Е.М. Серба [и др.] // Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 6. С. 48–57.
9. Дроздов В.Н. Рациональное возмещение дефицита витаминов и микроэлементов // Лечебное дело. 2009. № 3. С. 34–40.
10. Нутриом как направление «главного удара»: определение физиологических пот-ребностей в макро- и микронутриентах, минорных биологически активных веществах пищи / В.А. Тутельян [и др.] //Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 4. С. 24–34.
11. ГОСТ 13496.4-2019. Корма. Комбикорма. Комбикормовое сырье. Метод определения содержания азота и сырого протеина. М., 2019.
12. Культивирование микроорганизмов как основа биотехнологического процесса / С.Е. Алешина [и др.]. Оренбург, 2017.
13. Чернова А.П., Батжаргал Х. Метод оценки ферментативной активности хлебопекарных дрожжей // Пищевая промышленность. 2019. № 8. С. 84–88.
14. Использование экстрактов яблочного жмыха для интенсификации биосинтеза эргостерина / И.В. Калинина [и др.] // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Сер. «Пищевые и биотехнологии». 2021. Т. 9, № 2. С. 75–82.
