Астрахань, Астраханская область, Россия
УДК 579.64 Сельскохозяйственная микробиология
УДК 58.071 Влияние микроорганизмов
Цель исследования – изучение ферментативной активности и степени потемнения клубней картофеля, выращенного с применением биопрепарата на основе Bаcillus atrophaeus ВКПМ В-11474, разрабатываемого на кафедре «Прикладная биология и микробиология» Астраханского государственного технического университета. Объект исследования – ранний картофель рода Ред Скарлетт. Полевой эксперимент проводили на сельскохозяйственных полях в Камызякском районе Астраханской области. Выращивание картофеля осуществляли с применением следующих вариантов: контроль – выращивание картофеля без обработки биопрепаратами; Витаплан СП (биологический фунгицид на основе Bacillus subtilis) – коммерческий биопрепарат выбран для сравнения, использован в соответствии с рекомендациями по применению; ВП1 – жидкая форма биопрепарата на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474. Все исследования проводились по стандартным методикам. В процессе работы проводились исследования ферментативной активности (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы, амилаз-суммарной, α-амилазы, β-амилазы) и степени потемнения мякоти клубней картофеля в послеуборочный период и по окончании 4 месяцев хранения. В результате проведенных исследований клубней картофеля, выращенного с применением биопрепарата на основе B. atrophaeus, установлено отсутствие негативного влияния на ферментативные активности, происходящие в клубнях как при выращивании, так и при хранении. Преимуществом биопрепарата на основе B. atrophaeus является способность снижения активности амилаз как в свежесобранном урожае картофеля, так и при хранении, что оказывает пролонгированное действие, снижая вероятность накопления в клубнях редуцирующих сахаров и холодового осахаривания. Установлено, что степень потемнения опытных образцов с применением биопрепарата менее выражена, чем в контрольном варианте. Результаты исследований позволяют рекомендовать применение биопрепарата на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474 для биологической защиты ранних сортов продовольственного картофеля от альтернариоза.
картофель, биопрепарат, ферментативная активность, каталаза, пероксидаза, полифенолоксидаза, амилаза, степень потемнения мякоти клубней картофеля
Введение. Обеспечение населения страны безопасной, качественной и доступной сельскохозяйственной продукцией в настоящее время является основной стратегической целью достижения продовольственной безопасности в России [1].
Внедрение инновационных технологий и развитие экологически безопасных производств получения сырья и продукции – важные задачи «Стратегии национальной безопасности» [2].
Одним из приоритетных направлений в растениеводстве в настоящее время является переход на технологии выращивания, предусматривающие снижение или отказ от применения химических пестицидов с использованием интегрированных систем и биотехнологических подходов, одним из которых является применение различных биопрепаратов, биоудобрений, стимуляторов роста на основе микроорганизмов [3, 4].
Для обработки посевного материала, в процессе выращивания и при закладке на хранение сельскохозяйственного сырья и продукции, в настоящее время применяют микробные биопрепараты, разработанные на основе бактериальных штаммов Pseudomonas и Bacillus, которые способствуют максимальной сохранности качества и пищевой ценности продуктов, снижая микробиальную порчу и увеличивая продолжительность хранения продукции [5–7].
Однако очень мало исследований относительно аспектов, раскрывающих вопросы способности Bacillus проявлять антиоксидантные свойства, приводящих к их толерантности в неблагоприятных условиях окружающей среды как при выращивании сельскохозяйственной продукции, так и при хранении [8].
Применение микробных препаратов при выращивании и хранении в комплексе с повышенными температурами при выращивании и пониженными при хранении являются стрессовыми факторами для многих видов растительной продукции, оказывающими влияние на активность ферментов и, как следствие, на формирование качества продукции [6, 7].
Цель исследования – изучение ферментативной активности и степени потемнения клубней картофеля, выращенного с применением биопрепарата на основе Bаcillus atrophaeus ВКПМ В-11474, разрабатываемого на кафедре «Прикладная биология и микробиология» Астраханского государственного технического университета.
Задачи: провести анализ ферментативной активности и степени потемнения клубней раннего картофеля сорта Ред Скарлетт в полевом опыте и при последующем хранении.
Объекты и методы. Полевой эксперимент проводили на сельскохозяйственных полях в Камызякском районе Астраханской области. Объект исследований – ранний картофель сорта Ред Скарлетт. Исследования проводили согласно Методике полевого опыта [9, 10].
Определение активности ферментов и технологических свойств картофеля проводили на базе кафедры «Прикладная биология и микробиология» АГТУ.
Биопрепарат на основе штамма B. Atrophaeus ВКПМ В-11474 применялся в виде суспензии (ВП). Суспензию получали при непрерывном жидкофазном культивировании в промышленном ферментере на картофельно-глюкозной среде с титром жизнеспособных клеток не менее 109 КОЕ/мл.
Выращивание картофеля осуществляли с применением следующих вариантов: контроль – выращивание картофеля без обработки биопрепаратами; Витаплан СП (биологический фунгицид на основе Bacillus subtilis) – коммерческий биопрепарат выбран для сравнения, использован в соответствие с рекомендациями по применению (опрыскивание дна борозды перед посадкой, норма расхода 80 г/га); ВП1 – жидкая форма биопрепарата на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474, способ применения – опрыскивание дна борозды перед посадкой (1 %-й раствор. 300 л/га)+2 пролива под корень растений (100 мл/растение) в фазах бутонизации и массового цветения; ВП2 – двукратное опрыскивание растений (1 %-й раствор, 300 л/га) в фазах единичного цветения и в конце вегетации.
На хранение картофель закладывали после сбора урожая по окончании лечебного периода (14 суток при температуре 13–18 °С) насыпью при оптимальной температуре хранения для картофеля 1–4 °С в течение 4 месяцев.
Определение степени потемнения мякоти клубней картофеля в сыром и вареном виде проводилось визуальным методом. При визуальном определении степени потемнения картофеля были взяты образцы разных вариантов, разрезанные пополам. Одна половинка картофеля была сварена на пару для определения изменения цвета в вареном виде, вторая – оставлена на сутки на свету для определения степени потемнения мякоти в сыром виде. Учет потемнения проводился по следующей шкале, в баллах: 9 баллов – цвет не изменился; 7 баллов – слабое изменение цвета; 5 баллов – среднее окрашивание; 3 балла – сильное окрашивание; 1 балл – очень сильное окрашивание [11].
Активность ферментов (пероксидазы, каталазы, полифенолоксидазы, амилазы) определяли в клубнях до закладки на хранение (по окончании лечебного периода) и по окончании периода хранения.
Определение активности пероксидазы (ПО) проводили ферментативной реакцией окисления пирогаллола пероксидом водорода с образованием окрашенного соединения пурпурогаллина, количество которого оценивали фотоколориметрически (Фотометр КФК-3) и выражали в единицах оптической плотности раствора пурпурогаллина, образовавшегося под действием пероксидаз в расчете на 1 г растительной массы (далее ед. акт) [12].
Активность полифенолоксидазы (ПФО) на спектрофотометре ПромЭкоЛаб ПЭ-5300В определяли измерением оптической плотности продуктов реакции, образовавшихся при окислении пирокахетина за определенный промежуток времени, и выражали в относительных единицах на 1 г сырой ткани (далее ед. акт) [13].
Определение активности амилаз и каталазы проводили фотоколориметрически (Фотометр КФК-3) и выражали в мг гидролизованного крахмала на единицу времени в расчете на 1 г растительной массы (мг/ед. акт.) [12, 14].
Опыты проводили в 3 биологических и 3 аналитических повторностях. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью стандартных методов описательной статистики с использованием программ MS Excel [15]. Дисперсионный анализ цифровых данных полевого опыта осуществляли по Б.А. Доспехову [9], достоверность различий между вариантами определяли, сравнивая их с показателями наименьшей существенной разницы (НСР0,05).
Результаты и их обсуждение. Определение активности ферментов в клубнях картофеля до закладки на хранение показало (табл. 1), что в клубнях, выращенных при использовании биопрепарата на основе B. аtrophaeus, активность пероксидазы и каталазы находится практически на том же уровне, что и в контрольном варианте (табл. 1).
При закладке на хранение для всех образцов картофеля отмечена максимальная активность для полифенолоксидазы (ПФО) (табл. 1), при этом следует отметить повышенные значения в клубнях картофеля в вариантах, где применялась суспензия биопрепарата (ВП2), в сравнении с контролем (670,98 и 533,41 ед. акт. соответственно), практически незначительно уступая по активности ПФО в клубнях, выращенных при использовании коммерческого препарата Витаплан СП (677,25 ед. акт.).
Определение активности амилазы (суммарной, ɑ-амилазы и β-амилазы) показало (табл. 1), что применение биопрепарата на основе B. Atrophaeus ВКПМ В-11474 способствует значительному снижению активности данных ферментов в клубнях картофеля при закладке на хранение (в 6,45–7,8 раза), не уступая коммерческому препарату Витапалан СП (в 7,2 раза).
Таблица 1
Ферментативная активность в клубнях картофеля*, ед. акт.
|
Вариант опыта |
Пероксидаза |
Каталаза |
Полифенолоксидаза |
Амилаза суммарная |
α-амилаза |
β –амилаза |
|
Контроль |
0,02±0,0002 |
7,6±0,3 |
533,41±40,94 |
25,89±1,3 |
14,51±0,73 |
11,39±0,57 |
|
1,09±0,01 |
25±1,25 |
36,82±1,84 |
13,19±0,66 |
8,47±0,2 |
4,72±0,19 |
|
|
Витаплан, СП |
0,17±0,002 |
7,05±0,31 |
677,25±74,5 |
3,55±0,14 |
2,4±0,07 |
1,15±0,04 |
|
1,95±0,08 |
25,4±0,22 |
21,52±0,076 |
6,83±0,3 |
3,57±0,1 |
3,3±0,1 |
|
|
ВП1 |
0,07±0,007 |
8,0±0,32 |
592,98±65,23 |
4,01±0,04 |
2,71±0,1 |
1,3±0,04 |
|
1,24±0,037 |
22,45±1,12 |
32,93±1,55 |
8,1±0,3 |
2,86±0,1 |
5,25±0,16 |
|
|
ВП2 |
0,03±0,003 |
8,2±0,32 |
670,98±74,2 |
3,3±0,13 |
2,22±0,02 |
1,07±0,02 |
|
1,37±0,04 |
24,6±0,99 |
42,24±2,53 |
8,57±0,32 |
5,56±0,2 |
3,03±0,12 |
* – в числителе – до закладки на хранение; в знаменателе – по окончании хранения.
Учитывая то, что повышение уровней антиоксидантных ферментов каталазы, пероксидазы и полифенолоксидазы в ответ на воздействие стрессовых факторов окружающей среды является ключевым в защитных механизмах картофеля от проявления внешних агрессивных воздействий [16], можно предположить, что в целом применение суспензии биопрепарата на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474 способствует повышению иммунной системы клубней картофеля. Данное предположение подтверждается тем, что в полевом опыте перед уборкой урожая отмечена эффективность биопрепарата на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474 против развития такого заболевания, как альтернариоз, вызываемого Alternaria solani (табл. 2).
Кроме этого, присутствие бациллярных клеток и их экзометаболитов оказывает, вероятно, влияние на формирование химического состава ризосферы и ризопланы картофеля, что выражается в препятствовании всасывания присутствующих в почвах хлорид-ионов, имеющих функции активаторов амилаз. Данное предположение подтверждается тем, что в клубнях картофеля, выращенных с применением B. Atrophaeus ВКПМ В-11474, активность суммарной амилазы находится на минимальном уровне (3,3–4,01 ед. акт.) в сравнении с контролем (25,89 ед. акт.).
Таблица 2
Действие биопрепарата на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474 на развитие альтернариоза (Alternaria solani) на картофеле сорта Ред Скарлетт
|
Вариант |
Показатель развития, % |
||
|
Р* |
R** |
БЭ*** |
|
|
Контроль |
100,0 |
91,4 |
- |
|
Витаплан, СП (стандарт) |
96,9 |
65,2 |
28,7 |
|
ВП1 |
99,4 |
64,9 |
28,9 |
|
ВП2 |
99,8 |
67,1 |
26,6 |
|
НСР0,05 |
1,6 |
4,1 |
- |
* Р – распространение болезни, ** R – развитие болезни, *** БЭ – биологическая эффективность изучаемого препарата против заболевания.
Оценивая общие изменения работы ферментативных систем, утилизирующих активные формы кислорода (каталаза/пероксидаза), следует отметить, что за время хранения (4 месяца) отмечена некоторая перестройка ферментативных систем. Так, произошла перестройка оксидазных процессов: во всех образцах наблюдается увеличение активности как каталазы, так и пероксидазы, однако в разной степени. При определении активности пероксидазы (ПО) в клубнях картофеля во всех исследуемых вариантах наблюдается повышение активности ПО от 0,02–0,17 ед. акт. (до закладки на хранение) до 1,09–1,95 ед. акт. (по окончании хранения). В целом следует отметить, что активность ПО возросла в минимальной степени в клубнях, выращенных с применением биопрепарата B. atrophaeus ВКПМ В-11474 (17,7–45,7), в сравнении с контролем (в 54,5 раза). Рост активности пероксидазы показывает минимальные значения (в 11,5 раза) в варианте Витаплан СП, немногим больше (в 17,7 раза) в образце картофеля варианта ВП1, что является положительным фактором в формировании качества клубней в части снижения риска развития болезней при хранении.
Для каталазы в клубнях картофеля по окончании хранения также отмечено повышение данного показателя во всех исследуемых вариантах, но это повышение не такое существенное (2,8–3,6) в отличие от повышения активности ПО, что, вероятно, обусловлено тем, что чувствительность каталаз к низкой концентрации пероксида водорода ниже, чем у пероксидаз [16, 17].
Для ПФО по окончании периода хранения отмечается существенное снижение показателей (в 14,5–31,5 раза). Наибольшее снижение активности ПФО показали образцы Витаплан СП и ВП1, где снижение произошло в 31,5 и 18,0 раза соответсвенно, в варианте ВП2 – в 15,9 раза, что несколько выше, чем в контрольном варианте (в 14,5 раза).
В целом следует отметить, что при рассмотрении изменения активности ферментов в системе «полифенолоксидаза-каталаза-пероксидаза» образцы картофеля варианта ВП2 показали максимальные адаптационные изменения к окислительному стрессу в условиях хранения посредством перестройки ферментативных процессов.
Определение активности амилазы (суммарной, ɑ-амилазы и β-амилазы) показало (см. табл. 1), что по окончании периода хранения также происходит перестройка ферментативных процессов в клубнях картофеля, сопровождающаяся повышением активности данных ферментов в клубнях, которые выращивались при использовании биопрепаратов (Витаплан СП и на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474), тогда как в контроле активность данных ферментов снижается в среднем в 2 раза.
Следует отметить, что особенности изменения активности β-амилаз в образцах после хранения вполне коррелируют с данными по ɑ-амилазе, за исключением образца ВП1, в котором активность β-амилазы практически остается на первоначальном уровне.
Несмотря на то что при хранении картофеля, выращенного с применением биопрепарата на основе B. atrophaeus, отмечено увеличение активности амилаз в сравнении с контрольным вариантом, активность данной группы ферментов в обработанных биопрепаратами клубнях остается по окончании хранения значительно ниже активности в клубнях контрольного варианта.
В целом данная особенность свидетельствует о том, что применение биопрепарата на основе B. atrophaeus при выращивании раннего картофеля не только оказывает влияние на снижение активности амилаз в свежесобранном урожае картофеля, но и обладает пролонгированным действием.
Одним из основных технологических свойств, влияющих на качество картофеля, является степень потемнения мякоти клубней, влияние на данный показатель оказывают различные факторы, в том числе активность ферментов, содержащихся в картофеле [18–20].
Полученные данные (табл. 3) свидетельствуют о том, что потемнение мякоти клубней сырого и вареного картофеля, выращенного с применением биопрепарата на основе B. Atrophaeus, менее выражено, чем в контрольном варианте, что является важным условием при получении как столовых, так и технических сортов картофеля.
Таблица 3
Степень потемнения мякоти исследуемых образцов картофеля
|
Вариант |
Окраска |
Потемнение мякоти сырого картофеля, балл |
Потемнение мякоти вареного картофеля, балл |
|||
|
кожуры |
сырой мякоти |
после-уборочный период |
по окончании хранения |
после-уборочный период |
по окончании хранения |
|
|
Контроль |
Красный |
Светло-желтый |
5 |
3 |
7 |
6 |
|
Витаплан, СП (контроль) |
7 |
6 |
7 |
7 |
||
|
ВП1 |
8 |
7 |
8 |
8 |
||
|
ВП2 |
8 |
7 |
8 |
8 |
||
Заключение. В результате проведенных исследований установлено, что применение биопрепарата на основе B. atrophaeus не оказывает негативного влияния на формирование ферментативных активностей, происходящих в клубнях картофеля как при выращивании, так и при хранении, а также на степень потемнения мякоти клубней картофеля. Преимуществом биопрепарата на основе B. atrophaeus является способность снижения активности амилаз как в свежесобранном урожае картофеля, так и при хранении, что оказывает пролонгированное действие, снижая вероятность накопления в клубнях редуцирующих сахаров и холодового осахаривания.
Установлено, что степень потемнения опытных образцов с применением биопрепарата менее выражена, чем в контрольном варианте.
Результаты исследований позволяют рекомендовать применение биопрепарата на основе B. atrophaeus ВКПМ В-11474 для биологической защиты ранних сортов продовольственного картофеля от альтернариоза.
1. Об утверждении Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации. Указ Президента РФ от 21 января 2020 г. № 20. URL: https://www.consultant.ru/docu-ment/cons_doc_LAW_343386.
2. О стратегии национальной безопасности в Российской Федерации: Указ Президента Российской Федерации от 02.07.2021 г. № 400. URL: http://www.consultant.ru/docu-ment/cons_doc_LAW_389271.
3. Рубанов Н.И., Фомин А.А. Рынок биопродуктов в растениеводстве // Московский экономический журнал. 2018. № 3. С. 2. EDN YHKJYD.
4. Федоренко В.Ф., Мишуров Н.П., Коноваленко Л.Ю. Современные технологии производства пестицидов и агрохимикатов биологического происхождения. М.: Росинформагротех, 2018. 124 с. EDN XXPNML.
5. Кипрушкина Е.И., Колодязная В.С. Экспериментальное обоснование биотехнологических основ хранения растительного сырья // Доклады РАСХН. 2003. № 3. С. 47–49.
6. Кипрушкина Е.И., Колодязная В.С. Динамика содержания фенольных соединений при хранении клубней картофеля, обработанных биопрепаратами // Научный журнал НИУ ИТМО. Сер. «Процессы и аппараты пищевых производств». 2013. № 2. С. 8–9.
7. Горшков В.В., Савина О.В. Влияние осенней обработки препаратом «Биопаг» на пищевую ценность и технологические свойства клубней картофеля при длительном хранении // Вестник РГАТУ. 2016. № 1 (29). С. 18–22.
8. Bacillus: A Biological Tool for Crop Improvement through Bio-Molecular Changes in Adverse Environments / R. Ramalingam [et al.] // Front Physiol. 2017; 8: 667. Published online 2017 Sep 6. DOI:https://doi.org/10.3389/fphys.2017.00667.
9. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М.: Агропромиздат, 1985. 351 с.
10. Долженко В.И. Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве. СПб.: ВИЗР, 2009. 378 с.
11. Агросборник.Ру. https://agrosbornik.ru 2011–2017. https://agrosbornik.ru/drygoe/377-2011-10-27-17-37-19.html
12. Новиков Н.Н., Таразанова Т.В. Лабораторный практикум по биохимии растений: учеб. пособие. М.: Изд-во РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2012. 97 с.
13. Физиологические и биохимические методы анализа растений: практикум / авт.-сост. Г.Н. Чупахина; Калинингр. ун-т. Калининград, 2000. 59 с.
14. Пат. РФ 2027171. Способ определения активности каталазы в биологических объектах / Шиманов В.Г., Мукимов Т.Х., Кучинский С.Ю., Аслидинов С.Д., Халиков Р.А.; патентообладатель Узбекский НИИ каракулеводства. № 5000829/25; заявл. 05.07.1991; опубл. 20.01.1995
15. Лялин В.С., Зверева И.Г., Никифорова Н.Г. Статистика: теория и практика в Excel: учеб. пособие. М.: Финансы и статистика, 2010. 448 с.
16. Киргизова И.В., Гаджимурадова А.М., Омаров Р.Т. Особенности накопления антиоксидантных ферментов у растений картофеля в условиях биотического и абиотического стрессов // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2018. Т. 8, № 4. С. 42–54. DOI:https://doi.org/10.21285/2227-2925-2018-8-4-42-54.
17. Влияние обработки клубнеплодов биопрепаратами на интенсивность дыхания и активность оксидаз при их хранении / В.С. Колодязная [и др.] // Научный журнал НИУ ИТМО. Сер. «Процессы и аппараты пищевых производств». 2015. № 3. С. 64–70.
18. Болиева З.А., Басиев С.С., Козаева Д.П. Оценка потемнения мякоти сырого и вареного клубня картофеля гибридов селекции ФГБОУ ВО «Горский государственный аграрный университет» // Известия Горского государственного аграрного университета. 2016. Т. 53, № 2. С. 27–31. EDN WCFZKZ.
19. Вершинина Ю.А., Аношкина Л.С. Исходный материал для селекции картофеля на пригодность к промышленной переработке на хрустящий картофель, крахмал и спирт // Достижения науки и техники АПК. 2009. № 9. С. 15–17. EDN MEGJRB.
20. Гордеева А.В., Удалова Е.Ю. Оценка кулинарных качеств гибридов картофеля по признаку потемнения мякоти сырых и вареных клубней // Вестник Марийского государственного университета. Сер. «Сельскохозяйственные науки. Экономические науки». 2017. Т. 3, № 3 (11). С. 7–12. EDN ZSIUUX.
